[發(fā)明專利]一種濱麥基因組特異分子標(biāo)記的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811035249.0
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN108866237A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吉萬全;杜欣;王艷珍;師曉曦;王長有;陳春環(huán);田增榮;張宏
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種濱麥基因組特異分子標(biāo)記引物在濱麥品種鑒定過程中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述濱麥基因組特異分子標(biāo)記引物的序列如SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:34所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濱麥基因組特異分子標(biāo)記引物在濱麥品種鑒定過程中的應(yīng)用，其特征在于，將擴(kuò)增得到的濱麥序列與參考基因組和華山新麥草的序列進(jìn)行比對，從而得到濱麥特異的序列，具體應(yīng)用方法如下：

步驟1.將普通小麥7182、濱麥、華山新麥草用以上EST-STS特異性引物標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法如下：

(1)擴(kuò)增反應(yīng)體系，總體性10μL，包含以下成分：

(2)擴(kuò)增程序：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性45sec，

60℃退火45sec，

72℃延伸1min30sec，

循環(huán)35次；

72℃延伸10min；

12℃保存；

(3)整個過程在S1000型熱循環(huán)儀(Bio-Rad,California,USA)上進(jìn)行；

步驟2.瓊脂糖凝膠電泳

取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μL 6×Loading dye，混勻，用1.5％瓊脂糖凝膠檢測,通過紫外凝膠成像儀Champ Gel 5000掃描照相，統(tǒng)計條帶，分析多態(tài)性，并選取普通小麥7182、濱麥及華山新麥草間存在明顯差異且較明亮的條帶進(jìn)行切膠，將膠塊切下后放到對應(yīng)的編好號碼的1.5ml離心管，存放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟3.PCR產(chǎn)物切膠回收

PCR產(chǎn)物的切膠回收使用天根公司的Universal DNA Purification Kit，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行：

(1)吸附柱CB2中加入500ulBL，4℃，12000rpm，離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管；

(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量；

(3)向膠塊中加入等體積PC(如果膠塊重為0.1g，體積視為100ul，則加入100ulPC)，50℃水浴放置10min，期間不斷溫和的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；

(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB2中，4℃，12000rpm，離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管；

(5)向CB2中加入600ul漂洗液PW，使用前先加乙醇，4℃，12000rpm，離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管；

(6)重復(fù)(5)；

(7)將CB2放入收集管中，4℃，12000rpm，離心2min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于溫室放置數(shù)分鐘，徹底晾干；

(8)將CB2放入一個干凈離心管中，向吸附柱中間位置懸空滴加適量的68℃預(yù)熱的洗脫緩沖液，EB:ddH₂O＝2:1，室溫放置5min，4℃，12000rpm，離心2min，收集DNA溶液；

步驟4.PCR產(chǎn)物與載體的連接

使用TaKaRa公司的pMD19-T Vector進(jìn)行連接：

(1)連接體系：

回收的PCR產(chǎn)物 4.5ul

SolutionI 5.0ul

pMD19-T Vector 0.5ul

(2)16℃連接過夜，8～10h；

步驟5.配置固體LB培養(yǎng)基1L

調(diào)PH7.0，加10M NaOH，不含Amp，定容至1000ml；再在121℃滅菌30min；超凈臺上倒板；

步驟6.轉(zhuǎn)化

(1)將-80℃保存的DH5a感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶解；待溶解后，吸取5ul的連接產(chǎn)物于20ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打均勻，冰浴30min；

(2)42℃熱激75s，迅速在冰中冷卻3min：

(3)加入880ulLB培養(yǎng)基，不加抗生素，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1h；

(4)3500～4000rpm室溫離心2min，吸出600ul上清，吸打剩余菌液，混勻；

(5)吸出100ul，涂于Amp+/LB平板上，氨芐終濃度為100ug/ml；

(6)37℃倒置培養(yǎng)10h；

步驟7.挑菌

(1)準(zhǔn)備8連管表示后放入無菌操作臺，開紫外滅菌15-20min；

(2)每個PCR管加入30ul滅菌ddH₂O；

(3)用10ul的移液槍挑菌，每一個單一菌落對應(yīng)一個PCR管，輕輕吸打數(shù)次；

步驟8.菌落PCR檢測

為了驗證陽性克隆，進(jìn)行菌落PCR檢測，故將菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(1)擴(kuò)增體系10μL，如下：

(2)擴(kuò)增程序：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性45sec，

60℃退火45sec，

72℃延伸1min30sec，

循環(huán)35次；

72℃延伸10min；

12℃保存；

(3)整個過程在S1000型熱循環(huán)儀上進(jìn)行；

(4)瓊脂糖檢測

取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2μL 6×Loading dye，混勻，用1.5％瓊脂糖凝膠檢測,通過紫外凝膠成像儀掃描照相，分析條帶；

步驟9.測序

將單一條帶對應(yīng)的菌液加到含Amp+的液體LB培養(yǎng)基中37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)3-4h，再將篩選到的陽性菌落送到北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序部進(jìn)行測序；本文所有測序工作都由北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序完成；

步驟10.序列分析

由北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序出來的結(jié)果用BioEdit軟件以及NCBIhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在線分析。