[發明專利]一種人類肝纖維化、肝癌風險基因TNF-α多態性檢測試劑盒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811034967.6
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN108949968B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 馬曉晶;李倩;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 徐曉琴

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種人類肝纖維化、肝癌風險基因TNF?α多態性檢測試劑盒及其制備方法和應用。所述試劑盒包括用于擴增與肝纖維化、肝癌發病風險相關的風險基因TNF?αCR多態性的檢測試劑、陽性對照品及陰性對照品組成，所述檢測試劑包含用于擴增TNF?α基因的rs1800629位點的引物序列、PNA序列和PCR反應液。本發明所述試劑盒用于檢測人類肝纖維化、肝癌風險基因TNF?α多態性具有靈敏度高、特異性高、操作簡便、結果可靠等優點，且能在1小時內完成檢測，并且結果判讀簡單客觀。

技術領域

本發明屬于生物醫學臨床檢測技術領域，具體涉及一種人類肝纖維化、肝癌風險基因TNF-α多態性檢測試劑盒及其制備方法和應用。

背景技術

肝纖維化是指肝細胞受到炎癥刺激或發生壞死時，細胞外基質的增生與降解失去平衡，進而導致肝內結締組織異常沉積的病理過程。原發性肝癌居常見惡性腫瘤的第五位，每年約超過60萬人死于肝癌，在全球腫瘤相關性死亡中排名第三，我國患肝癌病例占全球的50％以上，對于肝癌的及時診斷和治療對于提高患者生存率具有重要意義。

肝纖維化過程涉及多種細胞和細胞因子，形成一個復雜的網絡系統調控肝纖維化的發生和發展。促纖維化因子TNF-α被認為是炎癥相關性腫瘤中最重要的細胞因子，多項研究證明其參與肝損傷、肝纖維化及肝癌病理的發生發展過程。研究表明TNF-α基因啟動子SNP(包括-1031、-863、-857、-376、-308、-238)可影響TNF-α的表達。大多研究表明TNF-α-308(G>A)與肝癌遺傳易感性有關，具有臨床檢測意義，當-308位點G被A替換后，TNF-α的轉錄效率會增加6～7倍，使TNF-α的表達量顯著上升。TNF-α-308(G>A)的SNP編號為rs1800629，位于TNF-α的啟動子區域。NCBI各個文獻中關于rs1800629等位基因人口多樣性中統計數據顯示亞洲人A等位基因基因型占比2.2～14.6％。文獻表明廣西壯族人群中正常對照組中A等位基因占比6.16％，而HCC患者占比17.16％，攜帶TNF-α-308A等位基因的個體患HCC的風險是攜帶G等位基因個體的3.153倍。該高頻SNP的檢測對于原發性肝癌的檢測有重要價值。

目前針對SNP檢測的常用方法有很多種，包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長度多態性方法、熒光定量PCR法、巢式PCR-探針法、原位雜交(ISH)等。最為常見的方法是測序法，該方法費用低，但耗時長、靈敏度不高；高分辨率熔解曲線法對設備要求比較高，不利于臨床推廣；傳統的熒光PCR法在臨床上應用較為廣泛，但檢測微量靈敏度不高。因此，我們建立一種操作方便、成本不高、較高靈敏度的熒光PCR法檢測肝纖維化、肝癌風險基因的多態性。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種人類肝纖維化、肝癌風險基因TNF-α多態性檢測試劑盒及其制備方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種用于人類肝纖維化、肝癌風險基因TNF-α多態性檢測的引物及PNA組，所述引物及PNA組包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端攜帶VIC熒光基團的鑒定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端攜帶FAM熒光基團的鑒定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的內參正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的內參反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端攜帶ROX熒光基團的內參鑒定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團的內參PNA。