[發(fā)明專利]一種人類肝纖維化、肝癌風(fēng)險(xiǎn)基因TNF-α多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811034967.6
• 申請(qǐng)日: 2018-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN108949968B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬曉晶;李倩;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 徐曉琴

1.引物及PNA組，其特征在于，所述引物及PNA組包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端攜帶VIC熒光基團(tuán)的鑒定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端攜帶FAM熒光基團(tuán)的鑒定引物、序列如SEQ IDNO.5所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團(tuán)的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團(tuán)的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的內(nèi)參正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的內(nèi)參反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端攜帶ROX熒光基團(tuán)的內(nèi)參鑒定引物、序列如SEQ IDNO.10所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團(tuán)的內(nèi)參PNA。

2.一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括檢測(cè)試劑、陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品；

所述檢測(cè)試劑包含：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端攜帶VIC熒光基團(tuán)的鑒定引物、序列如SEQ IDNO.4所示且5’端攜帶FAM熒光基團(tuán)的鑒定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團(tuán)的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團(tuán)的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的內(nèi)參正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的內(nèi)參反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端攜帶ROX熒光基團(tuán)的內(nèi)參鑒定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端攜帶BHQ淬滅基團(tuán)的內(nèi)參PNA、以及PCR反應(yīng)液；

所述陽性對(duì)照品包含：含TNF-α基因rs1800629-G、TNF-α基因rs1800629-A的重組質(zhì)粒和含內(nèi)參基因的重組質(zhì)粒的混合物；

所述陰性對(duì)照為不含內(nèi)參基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所示的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑中，序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所述引物的濃度為100~400nM，序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9所述引物的濃度為50~100 nM，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所述PNA的濃度為50~100 nM。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所示的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括Premix qPCRMIX以及TE緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所示的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照品為PUC-19質(zhì)粒空載

體。

6.權(quán)利要求2~5任一項(xiàng)所述檢測(cè)試劑盒在制備用于檢測(cè)人類肝纖維化、肝癌風(fēng)險(xiǎn)基因TNF-α多態(tài)性產(chǎn)品中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，具體的檢測(cè)方法包括如下步驟：

（1）采用基因組DNA提取試劑盒提取待測(cè)人外周血的基因組DNA作為待檢測(cè)樣本；

（2）熒光定量檢測(cè)：向反應(yīng)管中加入待檢測(cè)樣本和檢測(cè)試劑，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，然后將反應(yīng)管置于熒光PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并采集FAM、VIC和ROX熒光信號(hào)；

（3）PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)所采集的熒光信號(hào)起線情況進(jìn)行結(jié)果判定。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（1）中將所述待檢測(cè)樣本DNA稀釋到濃度為0.1~100ng/μL，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2）所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃1分鐘預(yù)變性；15個(gè)循環(huán)：95℃ 5秒，61℃ 32秒，不收集熒光；30個(gè)循環(huán)：95℃ 5秒，61℃ 32秒，采集熒光。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（3）所述結(jié)果判定的準(zhǔn)則為：①當(dāng)陽性對(duì)照組均有FAM、VIC、ROX熒光信號(hào)起線，陰性對(duì)照組均無FAM、VIC、ROX熒光起線，檢測(cè)樣本有ROX熒光信號(hào)起線時(shí)，判定實(shí)驗(yàn)成功，可以進(jìn)行后續(xù)分型判定；② 根據(jù)檢測(cè)樣本的FAM、VIC熒光信號(hào)判斷TNF-α基因rs1800629的分型：VIC熒光信號(hào)起線，TNF-α基因rs1800629分型為純合野生型；FAM熒光信號(hào)起線，TNF-α基因rs1800629分型為純合突變型；VIC、FAM熒光信號(hào)均起線，TNF-α基因rs1800629分型為雜合突變型。