[發(fā)明專利]一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811033762.6
• 申請(qǐng)日: 2018-09-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109251888A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚汝福
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都匯欣生命科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 成都天匯致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

本發(fā)明公開(kāi)了一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：臍帶采集與運(yùn)輸；臍帶組織的預(yù)處理；對(duì)臍帶華通膠組織塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。本發(fā)明通過(guò)分離方法，探索一種高效連續(xù)，能夠利用寶貴而有限的臍帶組織，最大限度的提高臍帶組織利用率以及間充質(zhì)干細(xì)胞獲得率、純化率的同時(shí)，縮短間充質(zhì)干細(xì)胞獲得周期的方法和路徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有較高的分化潛能，可向多個(gè)方向進(jìn)行分化。它在骨，軟骨，肌肉，肌腱，韌帶，神經(jīng)，肝，內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

目前從臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的主要方法有組合酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法普遍采用0.25％胰蛋白酶+0.1％膠原酶I型等體積混合對(duì)剪碎的臍帶組織進(jìn)行過(guò)夜消化10-24小時(shí)，經(jīng)過(guò)離心分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞基質(zhì)層成分，接種于內(nèi)表面處理后的培養(yǎng)耗材中，添加適量的干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱5.0％37℃培養(yǎng)；其缺點(diǎn)是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞大部分被消化酶消化裂解，臍帶組織只能利用一次，間充質(zhì)干細(xì)胞獲得率低，由于消化殘留的血管內(nèi)皮和表皮組織存在導(dǎo)致分離出的原代間充質(zhì)干細(xì)胞純度很低同時(shí)殘留酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有較大的抑制作用。

傳統(tǒng)貼壁法，采用PBS液體或0.9％生理鹽水反復(fù)多次洗凈臍帶組織中的臍帶血后，采用組織粉碎機(jī)破碎或醫(yī)用組織器械剪碎，直接貼壁到表面貼壁處理后的培養(yǎng)耗材中，加入干細(xì)胞完全培養(yǎng)基鋪滿包圍所有貼壁組織塊，放入二氧化碳培養(yǎng)箱5.0％37℃培養(yǎng)，每隔3-5天換一次液直至原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(需要10-15天)；原代長(zhǎng)滿后，將貼壁的組織塊廢棄處理，原代細(xì)胞傳代擴(kuò)增培養(yǎng)；其缺點(diǎn)是由于沒(méi)有去除臍帶表皮組織和臍帶內(nèi)血管組織，臍帶分離獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞的周期較大大延長(zhǎng)(至少10-15天，原代干細(xì)胞才能達(dá)到傳代擴(kuò)增水平)，同時(shí)原代間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)出伴隨著大量的表皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮成纖維細(xì)胞，從而使目的細(xì)胞純度大大很低，傳統(tǒng)貼壁法貼壁一次后，貼壁臍帶組織被廢棄掉也導(dǎo)致臍帶組織利用率很低，難以滿足未來(lái)市場(chǎng)化的需求。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

步驟1、臍帶采集與運(yùn)輸；

步驟2、臍帶組織的預(yù)處理；

步驟3、對(duì)臍帶華通膠組織塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

可選地，所述步驟1中的臍帶采集與運(yùn)輸具體為：按照無(wú)菌操作要求采集臍帶，符合臍帶供者采集標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)度不小于15厘米，保持完整，無(wú)針眼及破損，盡量避免臍帶與其他物品接觸，浸入采集瓶的保存液中，密封標(biāo)注，4°低溫轉(zhuǎn)運(yùn)箱盡快送往實(shí)驗(yàn)室，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)12小時(shí)。

可選地，所述步驟2中的臍帶組織的預(yù)處理具體為：

步驟2.1、提前半小時(shí)將生物安全柜開(kāi)機(jī)，窗口調(diào)至工作位置等待綠色LED“穩(wěn)定氣流”亮起，將臍帶用止血鉗從采集瓶中無(wú)菌取出，放入生物安全柜操作臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備好的玻璃皿中，75％酒精浸沒(méi)處理2分鐘；

步驟2.2、用止血鉗夾出臍帶轉(zhuǎn)移入新的皿中，0.9％生理鹽水浸沒(méi)清洗一遍，并用手術(shù)剪將臍帶組織剪成2cm長(zhǎng)組織塊，用敷料鑷擠出組織塊中殘留血液；

步驟2.3、用0.9％生理鹽水反復(fù)清洗組織塊，2-3次，直到浸沒(méi)組織的生理鹽水澄清透明；