[發(fā)明專利]一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811033762.6
• 申請(qǐng)日: 2018-09-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109251888A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚汝福
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都匯欣生命科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 成都天匯致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.一種從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、臍帶采集與運(yùn)輸；

步驟2、臍帶組織的預(yù)處理；

步驟3、對(duì)臍帶華通膠組織塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1中的臍帶采集與運(yùn)輸具體為：按照無(wú)菌操作要求采集臍帶，符合臍帶供者采集標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)度不小于15厘米，保持完整，無(wú)針眼及破損，盡量避免臍帶與其他物品接觸，浸入采集瓶的保存液中，密封標(biāo)注，4°低溫轉(zhuǎn)運(yùn)箱盡快送往實(shí)驗(yàn)室，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)12小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中的臍帶組織的預(yù)處理具體為：

步驟2.1、提前半小時(shí)將生物安全柜開(kāi)機(jī)，窗口調(diào)至工作位置等待綠色LED“穩(wěn)定氣流”亮起，將臍帶用止血鉗從采集瓶中無(wú)菌取出，放入生物安全柜操作臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備好的玻璃皿中，75％酒精浸沒(méi)處理2分鐘；

步驟2.2、用止血鉗夾出臍帶轉(zhuǎn)移入新的皿中，0.9％生理鹽水浸沒(méi)清洗一遍，并用手術(shù)剪將臍帶組織剪成2cm長(zhǎng)組織塊，用敷料鑷擠出組織塊中殘留血液；

步驟2.3、用0.9％生理鹽水反復(fù)清洗組織塊，2-3次，直到浸沒(méi)組織的生理鹽水澄清透明；

步驟2.4、用2把組織鑷將組織塊的表皮組織和血管內(nèi)皮組織剔除干凈，保留華通膠組織，放入無(wú)菌的新皿中；直至所有的組織塊處理完畢，用醫(yī)用手術(shù)剪，將收集的華通膠組織剪碎成2-5mm的華通膠塊，以備貼壁培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中的對(duì)臍帶華通膠組織塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)具體為：

步驟3.1、配置間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基；

步驟3.2、準(zhǔn)備用于步驟2.4收集待貼壁華通膠組織塊的T75cm²培養(yǎng)瓶，將華通膠組織塊按間隔1-2cm間距貼在T75cm²培養(yǎng)瓶底面，放入37℃5.0％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30分鐘蒸發(fā)掉組織表面水分，促使組織塊貼壁不容易脫落；

步驟3.3、將貼好華通膠組織快的T75cm²培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，在生物安全柜內(nèi)用10ml一次性血清移液管配上電動(dòng)移液器吸取步驟3.1中配置的完全培養(yǎng)基，加液量10ml/T75cm²培養(yǎng)瓶蓋好瓶蓋，輕輕放入37℃5.0％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

步驟3.4、每隔2-3天，對(duì)貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶進(jìn)行一次半換液或全換液，待貼壁華通膠組織塊原代間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到85％以上，對(duì)原代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行收集傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，輕輕拍培養(yǎng)瓶是貼壁的組織塊脫落，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基和懸浮組織塊收集到50ml無(wú)菌離心管中備用；再培養(yǎng)瓶中加入適量的0.9％生理鹽水清洗貼壁的原代細(xì)胞，重復(fù)2遍，加入1ml0.125％胰酶消化2分鐘，加入新鮮完全培養(yǎng)基中和，收集于新的50ml離心管用0.9％生理鹽水稀釋至50ml,離心1200rpm,5min棄上清，加完全培養(yǎng)基重懸按比例傳代擴(kuò)增培養(yǎng)；

步驟3.5、華通膠重復(fù)貼壁培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞：將步驟3.4離心管中第一次貼壁原代細(xì)胞傳代處理后的組織塊，加入0.9％生理鹽水反復(fù)清洗2遍，將組織塊殘余的培養(yǎng)液洗凈，用70um或100um細(xì)胞篩濾干水分，以備進(jìn)行再次貼壁；

步驟3.6、將步驟3.5中處理后的組織塊，按照步驟3.2-3.5的要求重復(fù)操作，如此使每根臍帶組織貼壁培養(yǎng)至少3-5次，即每根臍帶在不同的培養(yǎng)階段收獲至少3-5批次的原代間充質(zhì)干細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟3.1中的配置間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基具體為：將500mlLONZA無(wú)血清培養(yǎng)基、10mlPall血清替代物和5ml100XL-谷氨酰胺充分混合均勻，100X即每100ml培養(yǎng)基只需加1mlL-谷氨酰胺，制備得到間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述Pall血清替代物經(jīng)過(guò)0.2um針孔式濾器過(guò)濾。