[發明專利]一種人類哮喘風險基因多態性檢測試劑盒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811032806.3
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN109055366A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 晏星;李倩;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6858;C12Q1/6883
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 徐曉琴

1.引物組，其特征在于，所述引物組由普通的外引物和帶熒光標簽的特異性的ARMs引物組成，具體序列如下：用于擴增CYSLTR1基因rs7216389位點的特異性引物序列如SEQ IDNO.1~ SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團，SEQ IDNO.4所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團；用于擴增GSDML基因rs7216389位點的特異性引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團，SEQ ID NO.8所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團；用于內控的引物序列如SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.10所示。

2.探針組，其特征在于，所述探針組由特異性taqman-MGB探針和攜帶淬滅基團的鎖核酸探針組成，核苷酸序列如SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.13所示，具體形式如下：

內控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’

野生型淬滅基團鎖核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’

突變型淬滅基團鎖核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ 。

3.一種檢測試劑盒，包含權利要求1所述引物組和權利要求2所述探針組，其特征在于，所述試劑盒由分別用于擴增CYSLTR1、GSDML位點的PCR預混反應液、陽性對照品及陰性對照品組成；

所述PCR預混反應液的具體組分如下：

（1）用于擴增CYSLTR1位點的PCR預混反應液包括：所述用于擴增CYSLTR1基因rs320995位點的引物、引物序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示，用于內控的引物序列、序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.10所示，所述探針組、序列如SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.13所示，以及PCR反應液組成；

（2）用于擴增GSDML位點的PCR預混反應液包括：所述用于擴增GSDML基因rs7216389位點的引物、引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，用于內控的引物序列、序列如SEQID NO.9~ SEQ ID NO.10所示，所述探針組、序列如SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.13所示，以及PCR反應液組成；

所述陽性對照品包括：CYSLTR1基因rs320995位點野生型質粒、CYSLTR1基因rs320995位點突變型質粒、GSDML基因rs7216389位點野生型質粒、GSDML基因rs72163809位點突變型質粒及內參基因質粒DNA；

所述陰性對照品包含不包含內標基因和目的基因位點的重組質粒。

4.根據權利要求3所述檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR預混反應液中，探針組內taqman-MGB探針的濃度為50~100nM，攜帶淬滅基團的鎖核酸探針的濃度均為100~400nM；用于擴增各位點的不帶熒光基團的各引物濃度均為100~400nM，帶熒光基團的各引物濃度均為50~100nM；用于內控的引物的濃度均為100~400nM。

5.根據權利要求3所述檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括Premix qPCRmix和TE緩沖液。

6.權利要求3~5任一項所述檢測試劑盒在制備用于檢測人類哮喘風險基因多態性產品中的應用。

7.根據權利要求6所述應用，其特征在于，具體檢測方法包括如下步驟：

（1）采用基因組DNA提取試劑盒提取待測人外周血的基因組DNA作為待檢測樣本；

（2）熒光定量檢測：向反應管中加入PCR預混反應液和待測樣本DNA；同時設置陽性對照組和陰性對照組，然后將反應管置于熒光PCR儀進行PCR擴增反應，并采集FAM、VIC和ROX熒光信號；

（3）PCR擴增反應結束后，根據所采集的熒光信號起線情況進行結果判定。