[發明專利]一種番茄斑駁花葉病毒實時熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201811030758.4
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN108977584A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 柴阿麗;李寶聚;陳利達;石延霞;謝學文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.用于檢測番茄斑駁花葉病毒的引物對，為如下任一：

(a1)由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成的引物對；

(a2)由將SEQ ID No.1和SEQ ID No.2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a1)中所述引物對功能相同的引物對。

2.用于檢測番茄斑駁花葉病毒的試劑，包括權利要求1所述的引物對、SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增緩沖液和水。

3.根據權利要求2所述的試劑，其特征在于：所述SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增緩沖液，包括dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I、DNA聚合酶。

4.根據權利要求3所述的試劑，其特征在于：所述試劑中還含有參比染料；

具體的，所述參比染料為ROX參比染料。

5.用于檢測番茄斑駁花葉病毒的試劑盒，含有下述(b1)和(b2)：

(b1)番茄斑駁花葉病毒陽性質粒；

(b2)權利要求1所述引物對或權利要求2-4中任一所述的試劑。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述番茄斑駁花葉病毒陽性質粒為含有SEQ ID No.3所示DNA片段的質粒。

7.一種檢測待測樣本中是否含有番茄斑駁花葉病毒的方法，為如下(A1)或(A2)：

(A1)包括如下步驟：從待測樣本中提取總RNA并反轉錄得到cDNA，以所得cDNA作為模板，以權利要求1所述的引物對進行PCR擴增，得到擴增產物；然后按照如下確定所述待測樣本中是否含有番茄斑駁花葉病毒：如果所述擴增產物中含有169bp的DNA片段，則所述待測樣本中含有或候選含有番茄斑駁花葉病毒；如果所述擴增產物中不含有169bp的DNA片段，則所述待測樣本中不含有或候選不含有番茄斑駁花葉病毒；

(A2)包括如下步驟：從待測樣本中提取總RNA并反轉錄得到cDNA，以所得cDNA作為模板，以權利要求1所述的引物對進行熒光定量PCR擴增；然后根據擴增曲線按照如下確定所述待測樣本中是否含有番茄斑駁花葉病毒：如果所得擴增曲線為S型曲線，則所述待測樣本中含有或候選含有番茄斑駁花葉病毒；如果所得擴增曲線為一條直線，則所述待測樣本中不含有或候選不含有番茄斑駁花葉病毒。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述169bp的DNA片段為SEQ ID No.3所示DNA片段。

9.一種檢測待測樣本中番茄斑駁花葉病毒基因組cDNA含量的方法，包括如下步驟：

(d1)將權利要求5或6所述試劑盒中的番茄斑駁花葉病毒陽性質粒稀釋為系列已知濃度，分別作為模板，以權利要求1所述的引物對進行熒光定量PCR擴增，繪制熒光定量PCR標準曲線；

(d2)從待測樣本中提取總RNA并反轉錄得到cDNA，以所得cDNA作為模板，以權利要求1所述的引物對進行熒光定量PCR擴增；然后根據步驟(d1)所繪制的熒光定量PCR標準曲線得出所述待測樣本中番茄斑駁花葉病毒基因組cDNA的含量。

10.如下任一應用：

(c1)權利要求1所述的引物對在制備權利要求2-4中任一所述試劑或權利要求5或6所述試劑盒中的應用；

(c2)權利要求1所述的引物對或權利要求2-4中任一所述的試劑或權利要求5或6所述的試劑盒在檢測番茄斑駁花葉病毒中的應用，或者在制備用于檢測番茄斑駁花葉病毒的產品中的應用；

(c3)權利要求1所述的引物對或權利要求2-4中任一所述的試劑或權利要求5或6所述的試劑盒或權利要求7-9中任一所述的方法在對番茄斑駁花葉病毒所引起的疾病進行早期預測預報中的應用。