[發(fā)明專利]一種番茄斑駁花葉病毒實時熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811030758.4
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN108977584A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 柴阿麗;李寶聚;陳利達;石延霞;謝學文
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發(fā)明公開了一種番茄斑駁花葉病毒實時熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明提供了用于檢測番茄斑駁花葉病毒的引物對，為如下任一：a1)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物對；a2)由將SEQ ID No.1和SEQ ID No.2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與a1)中所述引物對功能相同的引物對。本發(fā)明提供的番茄斑駁花葉病毒熒光定量PCR檢測方法操作方便，快速，特異性強，靈敏度高；并且可以直接對田間番茄斑駁花葉病毒進行定量監(jiān)測，為病害的早期預測預報提供良好的基礎。因此，該方法適合于在植物病害診斷領域廣泛推廣應用。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種番茄斑駁花葉病毒實時熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

番茄斑駁花葉病毒(Tomato Mottle Mosaic Virus，簡稱ToMMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的新成員之一，是2013年在墨西哥的番茄上首次發(fā)現(xiàn)的新病毒，茄子和辣椒也是ToMMV的自然寄主，該病毒傳入和擴散風險較高。

目前檢測ToMMV的方法常以常規(guī)PCR技術為主，而該方法操作費時，制膠過程中含有致癌物質(zhì)EB，易危害科研人員健康和污染實驗室環(huán)境，同時樣品之間易形成交叉污染，導致檢測結果的假陽性。此外，常規(guī)PCR檢測技術可對病毒進行定性檢測，無法實現(xiàn)定量檢測。

目前，尚未有專門檢測ToMMV的專利及文獻相關報道，這對ToMMV來說，是一個重大損失，這將對茄科作物感染ToMMV的診斷及防控帶來負面影響。而茄子上ToMMV的發(fā)生一般伴隨著其他病毒(比如ToCV、ToMV、PVY、CMV、TSWV等)混合感染，而且ToMMV侵染發(fā)生的某種癥狀與其他病毒病極為相似，因此，難以通過肉眼從癥狀上進行區(qū)分；同時，在實驗室條件下，利用顯微鏡技術對病毒粒子進行形態(tài)觀察并不能做到有效精準判斷。因此，建立一種快速、準確的檢測ToMMV的熒光定量PCR體系非常必要。相對于常規(guī)PCR而言，應用實時熒光定量PCR檢測方法檢測植物病毒的主要優(yōu)點是實時性強，靈敏度高，特異性強，反應過程封閉，操作簡單等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種番茄斑駁花葉病毒的熒光定量PCR檢測方法。

第一方面，本發(fā)明要求保護一種用于檢測番茄斑駁花葉病毒的引物對。

本發(fā)明所提供的用于檢測番茄斑駁花葉病毒的引物對，可為如下任一：

(a1)由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成的引物對；

(a2)由將SEQ ID No.1和SEQ ID No.2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a1)中所述引物對功能相同的引物對。

其中，所述引物對中的兩條單鏈DNA既可以分別單獨包裝，也可以等摩爾混合包裝。

第二方面，本發(fā)明要求保護一種用于檢測番茄斑駁花葉病毒的試劑。

本發(fā)明所提供的用于檢測番茄斑駁花葉病毒的試劑，可包括前文所述的引物對、SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增緩沖液和水。

進一步地，所述SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增緩沖液，可包括dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I、DNA聚合酶。

更進一步地，所述試劑中還可含有參比染料。

在本發(fā)明的具體實施例方式中，所述參比染料具體為ROX參比染料(ROXReference Dye)。

第三方面，本發(fā)明要求保護一種用于檢測番茄斑駁花葉病毒的試劑盒。