[發明專利]一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法

在審

• 申請號: 201811027903.3
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109112100A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 曹祖兵;高迪;許騰騰;王怡青;童旭;張丹丹;張運海
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 沈尚林

本發明公開了一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，以豬的卵巢為原材料，通過卵巢采集、器材消毒、卵泡吸取、卵母細胞收集等步驟，收集卵母細胞的效果最佳，回收效率最高，能夠充分利用手中現有的資源，簡單、經濟、高效的回收豬小有腔卵泡的卵泡液以及卵丘卵母細胞復合體，對于今后有關于豬小有腔卵泡中的卵母細胞發育的研究以及畜牧業的發展提供了豐富的材料。

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，具體為一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法。

技術背景

現如今，隨著動物胚胎工程技術快速發展的同時，也極大的促進了畜牧業、養殖業以及生物醫學的進步。利用動物胚胎功能工程技術可以改良家畜品種、培育轉基因新品種、制備人類疾病模型、生產藥用蛋白、研究胚胎發育機理等。而豬是胚胎生物學家和遺傳學家研究的重要的模式動物之一，因為豬的生理和解剖結構與人類有很大的相似之處。

目前，如何在豬卵巢中簡單、高效的收集卵母細胞是開展后續體外成熟技術(IVM)、體外受精技術(IVF)、體細胞克隆技術(SCNT)、孤雌激活(PA)等現代動物胚胎生物技術必不可少的環節也是支持上述技術必不可少的保障，尤其是關于豬小有腔卵泡液以及卵泡液中卵丘卵母細胞復合體的收集則十分困難，因此發明一種簡單、經濟、方便、高效的卵母細胞收集方法就顯得十分重要。

發明內容

本發明的目的在于：提供一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，簡單、經濟、方便、高效，收集卵母細胞的效果佳，回收效率高，為今后有關于豬小有腔卵泡中的卵母細胞發育的研究以及畜牧業的發展提供了豐富的材料。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，包括以下步驟：

S1：卵巢采集：從屠宰場選取豬的卵巢，并將卵巢存放于盛裝有青霉素G和硫酸鏈霉素兩種抗生素的生理鹽水的保溫杯中，且保溫杯中溫度保持在28～35℃，2h內帶回實驗室；

S2：器材消毒：在實驗室中，將下一步驟所需用的器材全部進行消毒；

S3：卵泡吸取：采用5ml注射器針頭配合5ml無菌注射器針筒抽吸卵巢上的0.5～2mm的卵泡，并將抽取的卵泡液和卵母細胞緩慢注入置于38℃恒溫水浴鍋的15ml尖底離心管中，使卵丘卵母細胞復合體(Cumulus-Oocyte complexes,COCs)自然沉降；

S4：卵母細胞收集：用洗卵液將上一步驟自然沉降的卵泡液和卵母細胞稀釋到適宜濃度，再通過體式顯微鏡收集液體中的卵母細胞，從而完成豬小有腔卵泡中卵丘卵母細胞復合體的收集。

優選地，所述注射器針頭為健士牌一次性無菌注射器針頭。

優選地，所述S2步驟中進行消毒的器材，包括5ml注射器針頭、 5ml無菌注射器針筒、15ml尖底離心管。

優選地，所述S4步驟中的洗卵液的制備方法為：首先用100 mL去離子水溶解1gPVA(Polyvinyl alcohol，Sigma)，待PVA完全溶解，冷卻后再稱取9.55g DPBS粉末(Dulbecco’s phosphate buffered saline，Gibco，758054，無鈣鎂)，加去離子水，使溶解、定容至1L，勿攪拌；然后高壓前蓋上錫箔紙，高壓滅菌結束后冷卻，以1mL/L的比例加酚紅和雙抗；最后在超凈臺內，使用0.22μm 濾器，除菌后分裝至50mL離心管中，4℃保存，使用前38.5℃條件下預熱。

優選地，所述S1步驟中的生理鹽水，其制備方法包括以下步驟：

(1)、稱取1.3g青霉素(P3032)與1g鏈霉素(S1277)于15mL 胚胎培養水中，充分溶解后定容至20mL，再使用0.22μm濾器過濾除菌，制備成濃度為1000×的母液，將母液分裝到800μL的EP離心管中，每管分500μL，置于-20℃保存備用；