[發明專利]一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法

在審

• 申請號: 201811027903.3
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109112100A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 曹祖兵;高迪;許騰騰;王怡青;童旭;張丹丹;張運海
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 沈尚林

1.一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：卵巢采集：從屠宰場選取豬的卵巢，并將卵巢存放于盛裝有青霉素G和硫酸鏈霉素兩種抗生素的生理鹽水的保溫杯中，且保溫杯中溫度保持在28～35℃，2h內帶回實驗室；

S2：器材消毒：在實驗室中，將下一步驟所需用的器材全部進行消毒；

S3：卵泡吸取：采用5ml注射器針頭配合5ml無菌注射器針筒抽吸卵巢上的0.5～2mm的卵泡，并將抽取的卵泡液和卵母細胞緩慢注入置于38℃恒溫水浴鍋的15ml尖底離心管中，使卵丘卵母細胞復合體(Cumulus-Oocyte complexes,COCs)自然沉降；

S4：卵母細胞收集：用洗卵液將上一步驟自然沉降的卵泡液和卵母細胞稀釋到適宜濃度，再通過體式顯微鏡收集液體中的卵母細胞，從而完成豬小有腔卵泡中卵丘卵母細胞復合體的收集。

2.根據權利要求1所述的一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，其特征在于，所述注射器針頭為健士牌一次性無菌注射器針頭。

3.根據權利要求1所述的一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，其特征在于，所述S2步驟中進行消毒的器材，包括5ml注射器針頭、5ml無菌注射器針筒、15ml尖底離心管。

4.根據權利要求1所述的一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，其特征在于，所述S4步驟中的洗卵液的制備方法為：首先用100mL去離子水溶解1g PVA(Polyvinylalcohol，Sigma)，待PVA完全溶解，冷卻后再稱取9.55g DPBS粉末(Dulbecco’s phosphatebuffered saline，Gibco，758054，無鈣鎂)，加去離子水，使溶解、定容至1L，勿攪拌；然后高壓前蓋上錫箔紙，高壓滅菌結束后冷卻，以1mL/L的比例加酚紅和雙抗；最后在超凈臺內，使用0.22μm濾器，除菌后分裝至50mL離心管中，4℃保存，使用前38.5℃條件下預熱。

5.根據權利要求1所述的一種豬小有腔的卵丘卵母細胞復合體的收集方法，其特征在于，所述S1步驟中的生理鹽水，其制備方法包括以下步驟：

(1)、稱取1.3g青霉素(P3032)與1g鏈霉素(S1277)于15mL胚胎培養水中，充分溶解后定容至20mL，再使用0.22μm濾器過濾除菌，制備成濃度為1000×的母液，將母液分裝到800μL的EP離心管中，每管分500μL，置于-20℃保存備用；

(2)、稱取9g NaCl粉末(國藥集團)，用一次過濾Milli-Q水定容至1L，然后將液體分裝到300mL的玻璃瓶中，每瓶分裝250mL液體，分裝后高壓滅菌，備用；

(3)、選取1離心管步驟(1)中分裝好保存備用的青霉素和鏈霉素，然后吸取500μL，并添加到步驟(2)中備用的含250mL生理鹽水的玻璃瓶中，混勻，從而制得含有青霉素G和硫酸鏈霉素兩種抗生素的生理鹽水混合液。