[發(fā)明專利]一種川貝母內(nèi)生真菌介導(dǎo)納米銀的生物合成方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811027521.0
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109097405A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳衛(wèi);鄧克莉;蘇天驕;陳銀銀;侯凱;張慧慧;石憲
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P3/00
• 分類號: C12P3/00;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 成都環(huán)泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 51242
• 代理人: 趙紅欣;李斌

1.一種川貝母內(nèi)生真菌介導(dǎo)納米銀的生物合成方法，其特征在于，所述川貝母內(nèi)生真菌介導(dǎo)納米銀的生物合成方法包括：

利用川貝母內(nèi)生真菌浸泡液與硝酸銀溶液反應(yīng)，對分離得到的15株川貝母內(nèi)生真菌進(jìn)行初篩后，利用川貝母內(nèi)生真菌CBY4和CBY13通過生物合成法制備納米銀4-AgNPs和13-AgNPs；

生物合成過程中，合成條件為：pH3-11，硝酸銀溶液濃度為2mmol/L，2000Lux光照強，50℃。

2.如權(quán)利要求1所述的川貝母內(nèi)生真菌介導(dǎo)納米銀的生物合成方法，其特征在于，所述川貝母內(nèi)生真菌生物合成納米銀的合成方法進(jìn)一步包括：

(1)內(nèi)生真菌的發(fā)酵

菌株活化：從保存菌種的PDA斜面中挑取菌絲接入新鮮配制的PDA平板培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3-5d活化；

發(fā)酵液制備：在活化好的菌株平板邊緣用5mm打孔器打取菌餅，把菌餅按照一瓶一菌餅的方式接種到裝有PDB的三角瓶中；置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28℃，120r/min，振蕩培養(yǎng)7d；

(2)內(nèi)生真菌的菌體收集和二次發(fā)酵

過濾內(nèi)生真菌發(fā)酵液，收集菌體，用去離子水反復(fù)洗滌3-4次直至濾過液呈無色；取一定量的菌體浸泡在與原發(fā)酵體系相同體積的去離子水中進(jìn)行二次發(fā)酵，28℃，120r/min，振蕩培養(yǎng)24h。過濾菌體浸泡液，收集濾液；

(3)生物合成納米銀的初篩

新鮮配制濃度為1mmol/L的硝酸銀溶液，將菌體浸泡液和AgNO₃溶液按照9:1的比例進(jìn)行混合，常溫常壓條件下靜置反應(yīng)，將未添加AgNO₃溶液的等體積浸泡液設(shè)為空白對照；反應(yīng)一段時間后，結(jié)合UV-2600紫外可見分光光度計檢測納米銀特征吸收峰，判斷是否有納米銀合成產(chǎn)生的指標(biāo)；

(4)內(nèi)生真菌的鑒定。

3.如權(quán)利要求2所述的川貝母內(nèi)生真菌介導(dǎo)納米銀的生物合成方法，其特征在于，內(nèi)生真菌的鑒定包括：

a)形態(tài)學(xué)鑒定：

對篩選的菌株CBY4和CBY13進(jìn)行顯微形態(tài)特征分析；

b)分子生物學(xué)鑒定：

利用經(jīng)典的CTAB法提取川貝母內(nèi)生真菌CBY13的基因組DNA：

用無菌接種針挑取約5g左右的濕菌體放入研缽中，加入液氮研磨，將研磨好的細(xì)粉轉(zhuǎn)移到50mL的無菌離心管中,儲存在-20℃冰箱中過夜。

取出樣品向無菌離心管中加入15mL緩沖液，再加入3mL 5mol的NaCl和2mLCTAB裂解液，65℃孵育45min(，然后37℃孵育15min。

加入20mLde氯仿：異戊醇＝24:1混合液；混合均勻，室溫放置10min后，12000r/min離心20min，棄去上清液后加入11mL的異丙醇緩混勻；

用離心法8000r/min離心10min收集核酸顆粒，將沉淀下來的核酸顆粒用70％的乙醇洗凈，自然風(fēng)干10min；

將得到的核酸顆粒懸浮于5mL無菌水中；加入0.5mg DNase-free RNase，37℃孵育30min；

加入5mLde氯仿：異戊醇＝24:1混合液，再加5mL苯酚提取DNA；

加入4mL異戊醇沉淀DNA，然后8000r/min離心10min。

棄去上清液，沉淀下來的DNA顆粒用70％的乙醇洗凈，自然風(fēng)干，然后溶解于0.5mL的TE緩沖液中(10mM Tris-HCl and 0.1mmol EDTA,pH 7.5)；

用通用引物ITS1和ITS4擴增目標(biāo)ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)域：

PCR引物：上游引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和下游引物ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；

PCR體系：上下游引物各0.75μL，DNA溶液2.0μL，2×Taq PCR Master Mix 15μL，水11.5μL，整個體系共30μL；

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性45S，52℃退火30S，72℃延伸3min，40個循環(huán)，然后72℃延伸15min；

對擴增出來的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化后進(jìn)行測序，將所測序列提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)比對結(jié)果選取相似度最大且具有代表性的菌種利用MEGA5.10軟件采用neighbor-joining(NJ)法進(jìn)行聚類分析。