[發明專利]一種可靜脈注射的溶瘤病毒制劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201811026737.5
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109288875B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 劉剛;呂鵬;劉旋;陳笑梅;劉超;牟雅琳
• 申請（專利權）人: 廈門宏譜福生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/76
• 分類號: A61K35/76;A61K35/761;A61K9/08;A61P35/00
• 代理公司: 廣東品安律師事務所 44420
• 代理人: 劉井

本發明涉及一種可靜脈注射的溶瘤病毒制劑及其制備方法,本發明將靶向多肽基因轉染真核細胞，并將靶向多肽展示到細胞膜上，獲得穩定表達靶向多肽的基因工程改造細胞株后，利用該細胞株提取尺寸均一的納米級細胞膜囊泡，再將溶瘤病毒(OV)裝載到工程改造的細胞膜囊泡里，合成可靜脈注射同時靶向腫瘤遞送的溶瘤病毒復合體。本發明將溶瘤病毒裝載在細胞膜囊泡里面，能夠有效降低機體里中和抗體對溶瘤病毒的中和作用，同時細胞膜囊泡經過基因工程改造后具有靶向性，能夠實現溶瘤病毒的靶向遞送和在腫瘤部位的富集，同時降低溶瘤病毒的全身性副作用。

技術領域

本發明涉及一種可靜脈注射的溶瘤病毒疫苗的制備方法。

背景技術

溶瘤病毒療法是一種治療癌癥的理想治療方法，利用病毒能夠選擇性的在腫瘤細胞復制擴增的特性，溶瘤病毒疫苗在多項臨床前和臨床試驗中都取得了良好的治療效果。最近，美國FDA批準了安進公司的溶瘤病毒疫苗(T-VEC)用于皮膚和淋巴結黑色素瘤病變的治療。此外，幾項人體臨床試驗報告中也報道了在局部癌癥基因治療中使用溶瘤病毒的情況。然而，當溶瘤病毒直接進入機體的血液循環系統時，會引起機體固有的抗病毒免疫和先天免疫反應，以及溶瘤病毒容易在組織器官發生非特異性隔離等因素，使得傳統溶瘤病毒疫苗無法通過靜脈注射的方式進入機體，這對癌癥病毒療法的發展構成了重大的障礙。因此，迫切需要發展全新的溶瘤病毒遞送系統來解決上述問題。

發明內容

本發明的主要目的，在于提供一種可靜脈注射的溶瘤病毒復合體的制備方法，其包括如下步驟：將靶向腫瘤細胞的多肽基因轉染真核細胞，并將該多肽基因對應的靶向多肽展示到真核細胞的細胞膜上，獲得穩定表達靶向多肽的基因工程改造細胞株；然后利用該細胞株提取尺寸均一的納米級細胞膜囊泡，再將溶瘤病毒裝載到該納米級細胞膜囊泡里，得到可靜脈注射的溶瘤病毒復合體。

優選地，多肽基因包括PreS1、GPC3、HA、VEGF、PD-1/PD-L1、Trail中的至少一種。

優選地，多肽基因轉染真核細胞的方法包括電轉法、脂質體轉染法、PEI轉染、磷酸鈣轉染法、慢病毒或腺病毒轉染方法中的至少一種。

優選地，溶瘤病毒的種類包括溶瘤腺病毒、柯薩奇病毒、單純皰疹病毒(HSV)、麻疹病毒、新城病毒、脊髓灰質炎病毒、細小病毒、呼腸病毒、逆轉錄病毒中的至少一種。

優選地，將溶瘤病毒裝載進細胞膜囊泡的方法包括脂質體擠壓法、電轉法、超聲法、凍融法、皂化法中的至少一種。

優選地，真核細胞，包括MDCK細胞、VERO細胞、S2細胞、昆蟲細胞、胚胎干細胞、患者自體分離培養的細胞中的至少一種。

優選地，所述的靜脈注射的溶瘤病毒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

1)通過基因轉染的方法，將靶向多肽基因轉入真核細胞中，并通過靶向多肽基因中的信號肽將靶向多肽表達到細胞質膜上；

2)轉染24h后，使用500～550μg/ml的G418，對轉染的真核細胞進行篩選，每3～5天更換一次篩選培養基；篩選，至有抗性的克隆出現，停藥培養，待克隆逐漸增大；

3)挑取克隆團簇的細胞，胰酶消化后，將細胞通過有限稀釋法接種到細胞培養皿中，加入200～250μg/ml的G418對細胞維持篩選；

4)待單克隆細胞增大后，將其擴大培養，并重復步驟(3)的有限稀釋法進一步篩選穩定表達細胞株，經過多代的篩選獲得能夠穩定表達靶向多肽的細胞株；

5)取穩轉細胞株進行擴大培養，挑選生長對數期的細胞，PBS洗滌3～5次之后，加入含有PMSF蛋白酶抑制劑的低滲緩沖液，充分浸潤細胞；

6)將細胞收集起來，充分震蕩細胞使其均勻分散，將細胞懸液置于1-5℃下旋轉混懸，使細胞充分破裂形成大量細胞膜囊泡；