[發(fā)明專利]一種可靜脈注射的溶瘤病毒制劑及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811026737.5
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109288875B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設計）人: 劉剛;呂鵬;劉旋;陳笑梅;劉超;牟雅琳
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門宏譜福生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/76
• 分類號: A61K35/76;A61K35/761;A61K9/08;A61P35/00
• 代理公司: 廣東品安律師事務所 44420
• 代理人: 劉井

1.一種可靜脈注射的溶瘤病毒復合體的制備方法，包括以下步驟：

1）通過基因轉(zhuǎn)染的方法，將靶向多肽基因轉(zhuǎn)入真核細胞中，并通過靶向多肽基因中的信號肽將靶向多肽表達到細胞質(zhì)膜上；所述的靶向多肽基因包括PreS1、GPC3、HA、VEGF、PD-1、PD-L1、Trail中的至少一種；

2）轉(zhuǎn)染24h后，使用500～550μg /ml的G418，對轉(zhuǎn)染的真核細胞進行篩選，每3～5天更換一次篩選培養(yǎng)基；篩選，至有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待克隆逐漸增大；

3）挑取克隆團簇的細胞，胰酶消化后，將細胞通過有限稀釋法接種到細胞培養(yǎng)皿中，加入200～250μg /ml的G418對細胞維持篩選；

4）待單克隆細胞增大后，將其擴大培養(yǎng)，并重復步驟（3）的有限稀釋法進一步篩選穩(wěn)定表達細胞株，經(jīng)過多代的篩選獲得能夠穩(wěn)定表達靶向多肽的細胞株；

5）取穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株進行擴大培養(yǎng)，挑選生長對數(shù)期的細胞，PBS洗滌3～5次之后，加入含有PMSF蛋白酶抑制劑的低滲緩沖液，充分浸潤細胞；

6）將細胞收集起來，充分震蕩細胞使其均勻分散，將細胞懸液置于1-5℃下旋轉(zhuǎn)混懸，使細胞充分破裂形成大量細胞膜囊泡；

7）細胞混懸液在500～800×g下離心5～15min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，5000～8000×g下離心5～15min，最后將上清移到新的離心管，50000～80000×g下離心50～70min，移除上清，細胞膜沉淀用400～600ul緩沖液重懸，獲得細胞膜囊泡，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

8）將溶瘤病毒與細胞膜囊泡混合均勻，混合液用脂質(zhì)體擠壓器在350-450nm孔徑的薄膜下來回擠壓不少于15回合，進而將薄膜換成150-250nm孔徑薄膜，繼續(xù)來回擠壓不少于15回合，直至將溶瘤病毒顆粒裝載進細胞膜囊泡的空腔里，形成尺寸均一的細胞膜囊泡包裹溶瘤病毒，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可靜脈注射的溶瘤病毒復合體的制備方法，其特征在于:步驟1）所述的靶向多肽基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法包括電轉(zhuǎn)法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、PEI轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、慢病毒或腺病毒轉(zhuǎn)染方法中的至少一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可靜脈注射的溶瘤病毒復合體的制備方法，其特征在于，步驟1）所述的真核細胞，包括MDCK細胞、VERO細胞、S2細胞、昆蟲細胞、患者自體分離培養(yǎng)的細胞中的至少一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可靜脈注射的溶瘤病毒復合體的制備方法，其特征在于：步驟8）溶瘤病毒的種類包括溶瘤腺病毒、柯薩奇病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒、新城病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、細小病毒、呼腸病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒中的至少一種。