[發明專利]CO2休克法誘導產生腫瘤細胞凋亡小體及其抗腫瘤應用

在審

• 申請號: 201811023910.6
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109294992A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 劉安軍;呂淑明
• 申請（專利權）人: 慶云堂生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 陳娟

本發明涉及一種CO₂休克法誘導產生腫瘤細胞凋亡小體及其抗腫瘤應用，所述的凋亡小體是將腫瘤細胞放入不含CO₂培養箱中使腫瘤細胞凋亡得到的。本發明通過控制單個變量、利用分離、純化技術來收集腫瘤細胞凋亡小體，同時進行體內抗腫瘤試驗和體外指標檢測。結果表明對所收集的凋亡小體在狀態和數量上都有了一個精準的掌握，也具有很強的抗腫瘤作用。

技術領域

本發明屬于抗腫瘤技術領域，涉及腫瘤細胞凋亡小體，尤其是一種CO₂休克法誘導產生腫瘤細胞凋亡小體及其抗腫瘤應用。

背景技術

目前，腫瘤細胞凋亡小體的獲得主要是通過紫外線照射法、熱應力法等方法誘導細胞凋亡產生的。但是，這些方法需要控制的變量例如溫度、CO2濃度、時間等比較多，會造成結果的不準確。與此同時，通過物理方法制得的全細胞腫瘤疫苗并不能有效地解決腫瘤細胞抗原性弱的問題，因而其免疫活性相對比較低，抗腫瘤效率低。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種CO₂休克法誘導產生腫瘤細胞凋亡小體，同時提供了凋亡小體的保存方法、用途及其在抗腫瘤方面的作用。

本發明解決技術問題所采用的技術方案是：

本發明提供了一種腫瘤細胞凋亡小體的制備方法，具體操作為：

(1)將腫瘤細胞孵育至對數生長期，放入不含CO₂的培養箱中以誘導腫瘤細胞凋亡，同時對其進行體外指標檢測；

(2)細胞凋亡后，收集細胞的培養基上清液，吸入錐形離心管中，在室溫下700g～800g離心8min～10min，離心后，為去除上清中殘留的混雜細胞，再一次取上清重復離心一次；

(3)慢慢的將上清移至10ml的無菌注射器中，安裝濾膜過濾裝置，給予輕微壓力，緩慢使上清通過5μm的濾膜；

(4)離心管收集濾液，放入高速離心機中在4℃下，16000g～180000g離心18min～23min；

(5)管底灰色沉淀即為純化的腫瘤細胞凋亡小體。

為了消除培養基中的試劑或血清影響，將沉淀重新懸浮并用PBS洗滌，且在16000g～18000g下再離心30min～35min。

通過流式細胞分選術或差速離心技術可對所制備的腫瘤細胞凋亡小體進一步純化。

可以使用含有有效成分(如：多酚)的保存劑加入到通常用作細胞培養基的各種培養液中保存凋亡小體。同時也可以尋找一些合適的載體(如：基質、纖維等)，其可適合于凋亡小體的宿主，從而保存腫瘤細胞凋亡小體。

可制備含有凋亡小體的組合物，用于臨床實驗。例如該組合物可施用至有需要的哺乳動物，從而抑制炎癥、抑制免疫應答或自身免疫應答等。也可直接利用收集、純化的腫瘤細胞凋亡小體進行各種臨床實驗。

將所制備的凋亡小體作為抗腫瘤疫苗進行體內抗腫瘤試驗，確定其抗腫瘤作用。具體過程如下：建立小鼠腫瘤模型，將制備的凋亡小體進行皮下注射，注射量為25mg/kg左右，一周三次，之后接種腫瘤細胞，進行體內抗腫瘤指標檢測。

本發明的優點和積極效果是：

本發明針對現有的通過物理方法制備的全細胞腫瘤疫苗活性低的相關缺陷加以改善，進一步驗證其抗腫瘤作用。通過控制單個變量、利用分離、純化技術來收集腫瘤細胞凋亡小體，同時進行體內抗腫瘤試驗和體外指標檢測。結果表明對所收集的凋亡小體在狀態和數量上都有了一個精準的掌握，也具有很強的抗腫瘤作用。

附圖說明

圖1為“CO₂休克法”作用于HepG2細胞的顯微鏡觀察結果；