[發明專利]一種運載蛋白、重組表達載體、外泌體及制備方法與應用

在審

• 申請號: 201811023079.4
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109293745A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 謝秋玲;熊盛;王凱;季煜華
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K19/00;C12N15/11;A61K47/42
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 黃瑩;陳燕嫻

本發明提供了一種運載蛋白、重組表達載體、外泌體及制備方法與應用。所述的運載蛋白可以通過與外源目的蛋白融合，高效地攜帶外源目的蛋白進入外泌體中。本發明還提供了一種重組表達載體，可將待表達的外源蛋白肽段基因序列插入至所述的重組表達載體的多克隆位點上，實現高效、定向地使外源蛋白在細胞的外泌體中表達。同時，本發明還提供了一種攜帶外源蛋白的外泌體的制備方法，可有效地將外源目的基因帶入外泌體中，操作簡單易行，工藝穩定，適用性好。通過所述的制備方法制得的外泌體含有外源目的蛋白，并具有很好的細胞通透性，轉染細胞的效率高，同時可發揮外源目的蛋白的活性與功效，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種運載蛋白、重組表達載體、外泌體及制備方法與應用。

背景技術

1981年，Trams等在透射電鏡下發現了一組比多泡體還要小的、直徑在40～1000nm的囊泡樣物質。1987年，Johnstone等命名這種膜泡為外泌體(exosomes)，這種囊泡是由細胞質膜凹陷形成的，因而其外膜與細胞膜為同樣的物質，配體-受體相互作用、胞飲/吞噬或膜融合來進入受體細胞。天然形成的外泌體本身可以攜帶諸如RNA，蛋白質等大量成分。這些特點使得人們產生了將這種細胞天然產生的外泌體作為藥物包載系統的想法。

外泌體作為藥物載體進行藥物運輸有獨特的優勢，主要體現在：(1)當使用自源外泌體時，外泌體引起的有害免疫反應極低；(2)外泌體在人血液中的穩定性好；(3)向細胞轉運“貨物”的效率高；(4)外泌體運載藥物時具有一定的靶向性；(5)外泌體直徑在40～100nm之間，因此可以很好地利用增強滲透滯留(EPR)效應，有選擇性地滲入到腫瘤或者炎癥組織部位。

目前已經嘗試用外泌體攜帶siRNA，化學小分子藥物等進行基因治療和腫瘤治療等研究。然而對于大分子蛋白質藥物，用現在常用的電穿孔，轉染，孵育等包載藥物的手段則非常困難。同時，目前對于外泌體攜帶細胞內蛋白的機制仍不清楚，外泌體攜帶胞內物質都是隨機的，如何讓目的蛋白進入外泌體成為亟待解決的技術難題。

發明內容

本發明的第一目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種運載蛋白，該運載蛋白可以高效地攜帶外源目的蛋白進入外泌體。

本發明的第二目的在于提供編碼所述的運載蛋白的基因。

本發明的第三目的在于提供一種分泌表達外源蛋白的重組表達載體，該重組表達載體可以使外源蛋白在細胞中表達并將其攜帶進入外泌體。

本發明的第四目的在于提供一種攜帶外源蛋白的外泌體的制備方法。

本發明的第五目的在于提供所述的外泌體及其應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種運載蛋白，所述的運載蛋白可以高效地攜帶外源目的蛋白進入外泌體，其氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.1)：

MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVALDICSKNPCHNGGLCEEISQEVRGDVFPSYTCTCLKGYAGNHCETKCVEPLGLENGNIANSQIAASSVRVTFLGLQHWVPELARLNRAGMVNAWTPSSNDDNPWIQVNLLRRMWVTGVVTQGASRLASHEYLKAFKVAYSLNGHEFDFIHDVNKKHKEFVGNWNKNAVHVNLFETPVEAQYVRLYPTSCHTACTLRFELLGCELNARKADLRRGADDREQ

所述的運載蛋白包含與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％，優選至少95％，更優選地至少99％序列相同性的氨基酸序列，且可攜帶外源目標蛋白進入外泌體中。

如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸的氨基酸序列。