[發(fā)明專利]一種運載蛋白、重組表達載體、外泌體及制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811023079.4
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109293745A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝秋玲;熊盛;王凱;季煜華
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K19/00;C12N15/11;A61K47/42
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 黃瑩;陳燕嫻

1.一種運載蛋白，其特征在于：

其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運載蛋白，其特征在于：

所述的運載蛋白包含與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選地至少99％序列相同性的氨基酸序列，且可攜帶外源目標蛋白進入外泌體中。

3.一種編碼權(quán)利要求1或2任一項所述的運載蛋白的基因，其特征在于：

其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.權(quán)利要求1或2任一項所述的運載蛋白在基因、蛋白或藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用，所述的運載蛋白與待表達的外源目的蛋白進行融合表達后，所述的運載蛋白攜帶所述的外源目的蛋白進入外泌體中。

5.一種分泌表達外源蛋白的重組表達載體，其特征在于：

所述的重組表達載體含有權(quán)利要求1或2任一項所述的運載蛋白，并在所述的運載蛋白的基因序列后面添加多克隆位點序列，使其他所攜帶的目的蛋白在多克隆位點插入，在動物細胞中融合表達，并被帶入外泌體。

6.一種攜帶外源蛋白的外泌體的制備方法，其特征在于，包括如下制備步驟：

(1)構(gòu)建含有權(quán)利要求1或2任一項所述的運載蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段的重組表達載體，得到含有融合蛋白的重組表達載體；

(2)將所述的重組表達載體轉(zhuǎn)染細胞；

(3)培養(yǎng)陽性細胞，使陽性細胞分泌表達載有所述外源蛋白的外泌體；

(4)從細胞培養(yǎng)上清分離得到所述的外泌體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的攜帶外源蛋白的外泌體的制備方法，其特征在于：

步驟(1)的步驟為：將所述的運載蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段通過接頭連接后，利用限制性內(nèi)切酶切割，用T4DNA連接酶與表達載體進行連接，構(gòu)建得到重組表達載體，連接的順序為運載蛋白的基因片段-接頭-目的蛋白肽段基因片段；

所述的外源目的蛋白為EGFP蛋白、bFGF蛋白；

所述的接頭的氨基酸序列為DSAGSAGSAG；

所述的分離為通過超速離心方法或外泌體提取試劑盒從所述的細胞培養(yǎng)上清中分離得到所述的外泌體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的攜帶外源蛋白的外泌體的制備方法，其特征在于：

步驟(3)中所述的表達為穩(wěn)定表達或瞬時表達；

所述的表達載體為pcDNA3.4；

所述的超速離心方法的具體步驟為：

(1)300g離心細胞培養(yǎng)上清10min，2000g離心細胞培養(yǎng)上清10～20min，棄沉淀留取第一上清液，以去除細胞；

(2)第一上清液10000g離心30min，棄沉淀留取第二上清液，以去除亞細胞成分；

(3)第二上清液100000g離心70～90min，棄掉上清液，留取第一沉淀物，所述的沉淀為外泌體和一些可溶性蛋白；

(4)用PBS溶液重新懸浮步驟(3)得到的第一沉淀物，混勻后再以100000g離心70～90min，以洗去可溶性蛋白，洗滌沉淀后得到所述的外泌體；

步驟(1)～(4)均在4℃下進行。

9.一種外泌體，其特征在于：

通過權(quán)利要求6～8任一項所述的制備方法制備得到。

10.權(quán)利要求9所述的外泌體在基因、蛋白或藥物的遞送系統(tǒng)的應(yīng)用。