[發(fā)明專利]一種半滑舌鰨外泌體性別差異表達(dá)標(biāo)簽及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811019139.5
• 申請(qǐng)日: 2018-09-03
• 公開（公告）號(hào): CN109055520B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張博;賈磊;趙娜;李仰真;劉克奉;高磊;高燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津渤海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6879
• 分類號(hào): C12Q1/6879
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種半滑舌鰨外泌體性別差異表達(dá)標(biāo)簽及試劑盒，屬于魚類生物技術(shù)領(lǐng)域，所述microRNA性別標(biāo)簽為dre?miR?10d?5p，序列為TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG；以解決半滑舌鰨雄魚及偽雄魚在生殖遺傳差異的區(qū)分問題。本標(biāo)志miRNAs具有在雄魚和偽雄魚中顯著差異表達(dá)的特點(diǎn)，是特異的分子識(shí)別標(biāo)記。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于魚類生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是海水魚精液外泌體標(biāo)志物應(yīng)用領(lǐng)域，具體地為一種半滑舌鰨外泌體性別差異表達(dá)標(biāo)簽及試劑盒。

背景技術(shù)

半滑舌鰨雌、雄魚生長(zhǎng)速度差異巨大，無論是自然界還是養(yǎng)殖環(huán)境都不同程度的存在著偽雄魚。偽雄魚的染色體是ZW型，而它的生殖器官則和雄魚一樣，也可以產(chǎn)生精子且繁育后代。偽雄魚還可通過遺傳逐代積累，就導(dǎo)致了半滑舌鰨雌雄比例的失衡。因此開發(fā)鑒別半滑舌鰨偽雄魚的方法不僅具有理論意義，而且也具有生產(chǎn)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。

魚類性別鑒定有多種方法：生理解剖觀察、性腺切片、性腺細(xì)胞觀察、雌性特異分子標(biāo)記等。有些方法雖然簡(jiǎn)單易行，但是結(jié)果可能不準(zhǔn)確，有些方法則需要剖殺魚。外泌體內(nèi)含物microRNAs，其在進(jìn)化上高度保守，性質(zhì)穩(wěn)定，易于定量檢測(cè)，具有生物標(biāo)簽的特性，對(duì)于魚類性別鑒定的具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)半滑舌鰨雄魚及偽雄魚識(shí)別問題，提出一種半滑舌鰨精液來源的外泌體microRNAs作為生物標(biāo)記物識(shí)別雄魚及偽雄魚的方法。

本發(fā)明是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

半滑舌鰨精漿外泌體microRNA在性別鑒定中的應(yīng)用，microRNA性別標(biāo)簽為dre-miR-10d-5p，其序列為TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG。

本發(fā)明還提供一種所述microRNA性別標(biāo)簽的篩選方法如下：

1)精漿外泌體分離鑒定后，對(duì)精漿外泌體smallRNA進(jìn)行測(cè)序分析，將clean reads依次和Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)、cDNA序列、物種重復(fù)序列庫(kù)、miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果中的smallRNA進(jìn)行分類注釋；將分類注釋后的序列和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行已知microRNA的統(tǒng)計(jì)；使用未注釋上的序列進(jìn)行新的microRNA預(yù)測(cè)，microRNA差異表達(dá)分析，差異表達(dá)miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后與樣品進(jìn)行相關(guān)性匹配，篩選出一種或者多種，對(duì)兩種樣品具有指示作用的microRNA作為候選microRNAs生物標(biāo)記物；

2)將候選標(biāo)簽microRNAs按照以下四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾：(1)在兩種樣品中表達(dá)有極顯著差異，即p值小于0.01；(2)與已知數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)存在的microRNAs；(3)兩樣品中至少有一個(gè)的TPM值大于10；(4)foldChange值大于4，所述foldChange值＝TPM_{Sample_ZZ}./TPM_{Sample_ZW}；最終篩到了23個(gè)micro RNA作為候選標(biāo)簽進(jìn)行驗(yàn)證。

3)提取兩組驗(yàn)證樣本：經(jīng)外周血染色體鑒定后的雄魚及偽雄魚精漿來源外泌體總RNA，利用Micro RNA定量分析試劑盒定量檢測(cè)步驟2)過濾后的microRNAs的差異表達(dá)情況，篩選出最具標(biāo)簽指示作用的miRNAs作為最終的標(biāo)簽microRNAs；根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析原理，P值小于0.05為顯著差異，最終篩選到dre-miR-10d-5p，序列為TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG，此種標(biāo)簽在雄魚樣本中有高表達(dá)，而在偽雄魚樣本中表達(dá)量極低。依據(jù)MicroRNA定量分析結(jié)果，進(jìn)行雄魚和偽雄魚的判定。