[發明專利]一種篩選四逆湯抗心肌缺血藥效物質基礎的方法

有效

• 申請號: 201811015131.1
• 申請日: 2018-08-31
• 公開（公告）號: CN109115933B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 譚光國;周倩;孟平;王海波;陳鵬
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/54
• 代理公司: 西安創知專利事務所 61213
• 代理人: 譚文琰

1.一種篩選四逆湯抗心肌缺血藥效物質基礎的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的確定和峰面積的測定

步驟101、確定四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物：

步驟1011、四逆湯的制備：分別稱取60g附子、40干姜和60g甘草，然后加入1600mL純凈水浸泡1h后煎煮2h，趁熱用四層紗布過濾，得到一次濾液和一次殘渣，向一次殘渣中加入1200mL純凈水煎煮1h，再次趁熱用四層紗布過濾，得到二次濾液和二次殘渣，合并一次濾液和二次濾液，經減壓濃縮后得到濃度為1g/mL的四逆湯，即每毫升四逆湯相當于附子0.375g，干姜0.25g，甘草0.375g；

步驟1012、樣品的采集與制備：取雄性SD大鼠分成三組，分別為空白組、模型組和模型給藥組，其中模型給藥組口服給予四逆湯，四逆湯劑量為10mL溶液/1000g大鼠體重，空白組和模型組口服給予同體積生理鹽水，各組每日灌胃給藥1次，連續10d，在第9d和第10d對模型給藥組和模型組制備心肌缺血模型，對空白組給予同體積的生理鹽水；

步驟1013、樣品分析：取步驟1012中各組大鼠的血清樣品各100μL，分別加入400μL含有12.5 μg/mL內標物L-2-氯丙苯氨酸的甲醇渦旋1min，然后均置于冰水浴中超聲提取10min，再在4℃、14000×g的條件下離心15min，得到的上清液采用超高效液相色譜/四極桿-飛行時間質譜進行檢測分析，得到各組血清樣品的數據，其中超高液相色譜分析的條件為：超高液相色譜采用Agilent1290 Infinity 液相色譜系統，色譜柱填料使用ACQUITY UPLC HSST3 C18，規格為2.1mm×100mm，1.7μm，柱溫為40℃，流動相中的A相為甲酸質量含量0.1%的甲酸水溶液，B相為甲酸質量含量0.1%的甲酸乙腈溶液，流速為400μL/min，進樣量為4μL，其中質譜條件為：質譜采用Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF)質譜儀，采用正離子模式檢測，檢測參數中的毛細管電壓為3500V，干燥氣流速為11L/min，干燥氣溫度為350℃，噴霧氣壓為45psig，破碎電壓為120V，錐孔電壓60V，數據采集范圍質荷比m/z為50~1000；

步驟1014、四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的確定：首先根據步驟1013中各組血清樣品的數據，對比空白組與模型組的內源性代謝物的變化，采用正交偏最小二乘法分析并確定模型組異常變化的內源性代謝物，然后以模型組異常變化的內源性代謝物為潛在的藥效指標，對比模型組與模型給藥組的異常變化的內源性代謝物，采用方差分析法分析四逆湯干預后異常變化的內源性代謝物中明顯逆轉的代謝物，確定了四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物；所述明顯逆轉的代謝物的方差分析結果中p0.05；

步驟102、四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的峰面積的測定：

步驟1021、采用超高效液相色譜/三重四極桿質譜，通過多反應監測模式對步驟1014中確定的13種四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的特征離子進行掃描，得到相應的譜圖；

步驟1022、通過定量分析軟件MassHunter Quantitative Analysis對步驟1021中得到的相應的譜圖中的色譜峰面積進行積分，得到四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的含量信息；

步驟二、四逆湯體內移行成分的確定和峰面積的測定

步驟201、四逆湯體內移行成分的確定：根據步驟1013中各組血清樣品的數據，分別建立空白組與模型組間的正交偏最小二乘法判別分析模型和空白組與模型給藥組間的正交偏最小二乘法判別分析模型，然后以空白組與模型組間的正交偏最小二乘法判別分析模型權重載荷因子為橫坐標，以空白組與模型給藥組的正交偏最小二乘法判別分析模型權重因子為縱坐標，應用Simca-p統計軟件version 14.1構建SUS-plot即共享獨特結構圖，篩選四逆湯在模型給藥大鼠體內的移行成分，確定落在縱坐標軸正方向上的變量為四逆湯在模型給藥大鼠體內的移行成分；

步驟202、四逆湯體內移行成分的峰面積的測定：

步驟2021、采用超高效液相色譜/三重四極桿質譜，通過多反應監測模式對步驟201中確定的四逆湯體內移行成分的特征離子進行掃描，得到相應的譜圖；

步驟2022、通過定量分析軟件MassHunter Quantitative Analysis對步驟2021中得到的相應的譜圖中的色譜峰面積進行積分，得到四逆湯體內移行成分的含量信息；

步驟三、四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的峰面積與四逆湯體內移行成分的峰面積的相關性分析：將步驟1022中得到的四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的含量信息與步驟2022中得到的四逆湯體內移行成分的含量信息進行Pearson相關分析，用相關系數r表示四逆湯體內移行成分對四逆湯抗心肌缺血的內源性代謝物的作用程度，其中|r|≥0.6表示顯著相關，從而篩選出四逆湯抗心肌缺血藥效物質基礎。