[發明專利]一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法

在審

• 申請號: 201811012024.3
• 申請日: 2018-08-31
• 公開（公告）號: CN109234266A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 徐雙貴;胡培;李壘
• 申請（專利權）人: 安徽省新康飼料有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N9/02;C12R1/69
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S01：在培養皿中通過亞硝基胍對米曲霉高產漆酶進行誘變；

步驟S02：選取突變型的菌株轉接至PDA板培養，得到液體菌種；

步驟S03：將液體菌種以體積比20％-50％接種到漆酶產酶培養基，獲取粗米曲霉高產漆酶；

步驟S04：對粗米曲霉高產漆酶進行提純，得到米曲霉高產漆酶；

步驟S05：葵花粕洗凈烘干后粉碎成粒；

步驟S06：在無菌罐內加入葵花粕粒和培養營養液，攪拌至固液混合均勻并顯平坦狀；

步驟S07：在無菌罐中接種米曲霉高產漆酶；

步驟S08：培養結束后，105℃下烘干至恒重，木質素降解完成。

2.根據權利要求1所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟S01中，米曲霉高產漆酶的具體的誘變方法如下：

步驟Y01：在培養皿中的完全固定培養基表面涂布待處理的米曲霉高產漆酶懸液；

步驟Y02：在培養皿中央加上亞硝基胍晶體；

步驟Y03：通過接種環緊靠亞硝基胍制菌圈外側；

步驟Y04：將菌苔挑置與無菌生理鹽水中制成菌懸液；

步驟Y05：對菌懸液的突變型進行選擇。

3.根據權利要求2所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟Y01中，亞硝基胍對米曲霉高產漆酶誘變之間需要先對培養皿中的對米曲霉高產漆酶進行紫外線誘變，具體步驟為：先開啟紫外燈余熱20min-30min，穩定后啟動培養皿中的無菌攪拌鐵芯，使紫外線照射均勻，開啟培養皿蓋，取出處理箱，在紅光下涂布培養皿，用黑布包裹平板PDA板，進行振蕩培養。

4.根據權利要求2所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟Y04中，菌苔要進行離心處理，反復有生理鹽水洗滌離心10次以上，直至菌苔稀釋至原來了的80-110倍。

5.根據權利要求1所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟S03中，漆酶產酶培養基放置在25℃-37℃下靜置培養5d-7d后，加入1-10mM藜蘆醇，繼續培養3d-15d后，培養物過濾獲得粗米曲霉高產漆酶。

6.根據權利要求1所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟S04中，粗米曲霉高產漆酶提純依次經過硫酸銨沉淀、疏層析、離子交換柱層析和超濾管濃縮后得到電泳純的米曲霉高產漆酶。

7.根據權利要求1所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟S07中，無菌罐中接種米曲霉高產漆酶時，將無菌罐放置在28℃下160r/min振蕩培養14d-20d；其中，每2d取樣一次，測定發酵液中菌株的活性。

8.根據權利要求1所述的一種亞硝基胍誘變米曲霉漆酶降解葵花粕中木質素的方法，其特征在于，所述步驟S08完成后，還需通過Van Soest方法測定木質素的降解率；具體的降解公式為：

降解率＝[木質素的降解總量/原樣品中木質素的總量]×100％。