[發明專利]小麥過氧化氫酶在改善面粉加工品質中的應用

有效

• 申請號: 201811004480.3
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN109006917B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 胡松青;張亞萍;侯軼;劉光毅
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;A21D8/04;C12N15/53;C12N15/81
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

1.小麥過氧化氫酶在改善面團及面包品質中的應用，其特征在于：所述的小麥過氧化氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：

所述的小麥過氧化氫酶在面粉中的添加水平為1000～3000U/g面粉。

3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于：

編碼所述小麥過氧化氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于：

所述的小麥過氧化氫酶通過對轉化有真核重組表達載體的畢赤酵母進行發酵獲得；

所述的真核重組表達載體為包含小麥過氧化氫酶基因的真核重組表達載體。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：

所述的小麥過氧化氫酶的畢赤酵母重組表達方法，包括如下步驟：

（1）小麥過氧化氫酶基因的克隆

以小麥基因組為模板，以F2和R2為引物進行PCR擴增，得到過氧化氫酶基因，純化回收PCR產物；

F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；

R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′；

（2）重組表達載體的構建

將酵母真核表達載體與步驟（1）所得的PCR產物分別用Xho I和Xba I雙酶切，連接所得雙酶切產物并轉化大腸桿菌，篩選得到陽性克隆菌株，抽提質粒，得到小麥過氧化氫酶重組表達載體；

（3）小麥過氧化氫酶重組表達菌株的構建

將步驟（2）所述的小麥過氧化氫酶重組表達載體線性化后轉化至畢赤酵母中，使用步驟（1）所述的引物進行畢赤酵母基因組PCR，篩選得到陽性重組表達菌株；

（4）將步驟（3）所得的陽性重組表達菌株接種至BMGY液體培養基中，25～35 ℃、150～250 r/min條件下過夜振蕩培養；3000g條件下常溫離心5min，收集菌體沉淀；將菌體沉淀轉接至BMMY液體培養基中，轉接后的菌液OD_600nm為1.0～5.0；25～35 ℃、150～250 r/min條件下繼續培養48～120h，期間每隔24h向培養基添加甲醇至終濃度為0.5%～2.5%v/v，固液分離后獲得發酵上清液；即得小麥過氧化氫酶重組表達產物。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：

所述的小麥過氧化氫酶的畢赤酵母重組表達方法，還包括：

（5）將步驟（4）所得發酵上清液經硫酸銨分級沉淀和陰離子交換層析后，獲得純的重組小麥過氧化氫酶。

7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于：

步驟（1）中，所述的小麥為“煙農19”品種小麥；

步驟（2）中，所述的酵母真核表達載體為酵母真核表達載體pPICZαA；

步驟（2）中，所述的大腸桿菌為大腸桿菌DH5a；

步驟（3）中，所述的畢赤酵母為畢赤酵母X33；

步驟（4）中，所述的BMGY液體培養基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、無氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸鹽0.1mol/L、生物素0.4mg/L；

步驟（4）中，所述的BMMY液體培養基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、無氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸鹽0.1mol/L、生物素0.4mg/L、甲醇5mL/L。

8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：

步驟（5）中，所述的硫酸銨鹽析分級沉淀第一次沉淀所用硫酸銨濃度為15～30%飽和度，第二次沉淀為45～60%飽和度；所述的陰離子交換層析所用層析柱為Mono Q柱。