[發明專利]基于CRISPR-Cas的等溫核酸檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201811001245.0
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN109055499B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 韓序;高曉慶;馬秀玲;施慧玲;段昆;歐陽川
• 申請（專利權）人: 杭州杰毅生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開了一種基于CRISPR?Cas的常溫等溫快速檢測核糖核酸的技術及檢測方法。本發明旨在生物體外利用公開的多種基因工程酶與化學組分進行核糖核酸擴增，并通過一種或多種核酸酶，在常溫等溫條件下實現快速、一步或兩步的完成特定核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的擴增與檢測過程，使對各種核酸的檢測更快速和更簡便。包括以下步驟:(1)通過核酸提取得到待檢測樣本的RNA或單鏈DNA或雙鏈DNA；(2)利用逆轉錄酶、轉錄酶、核糖核酸酶H、CRISPR相關蛋白13的組合酶以及核酸熒光探針與待檢核酸在等溫進行反應，若待檢測核酸為DNA，在反應前增加預變性的步驟；(3)通過檢測熒光信號，判斷待檢測樣本中是否存在目標核酸。

技術領域

本發明是一種新的核酸等溫擴增檢測技術，利用逆轉錄酶、RNA聚合酶和Cas13a蛋白在常溫等溫條件下，可快速、一步、單管的完成針對特定DNA或RNA的擴增和檢測反應。

背景技術

脫氧核糖核酸(DNA)用聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增和檢測已經是分子檢測領域最為經典和通用的方法。同樣，RNA的體外擴增大多是利用PCR的衍生技術，逆轉錄PCR進行的。逆轉錄PCR一般分兩步，第一步先利用逆轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA，之后再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而實現RNA的擴增和檢測。然而，PCR本身需要依賴高精密的溫度循環儀進行檢測，且污染控制較為嚴格，基于PCR的RNA檢測局限于中心實驗室，對于現場快速檢測有很大的限制。

除了PCR，基于核酸雜交的技術也是非常常用的檢測方法，DNA或RNA分子先轉移并固定到硝酸纖維素或尼龍膜上，與其互補的單鏈DNA或RNA探針用放射性或非放射性進行標記。在膜上雜交時，核酸探針通過氫鍵與其互補的靶序列結合，洗去未結合的游離探針后，經放射自顯影或顯色反應檢測特異結合的探針。這個方法目前應用也相當廣泛，優點是可以一次分析大量樣品，缺點是容易出現假陽性。同時，核酸雜交的反應時間較長也是一個難以克服的缺點，也無法滿足現場快速檢測的需要。

近年來發展出很多新的核酸等溫擴增檢測技術，1)環介導等溫擴增技術(LAMP)利用4對引物特異識別6個靶位點和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，可在60-65度條件下實現核酸快速擴增和檢測(一般小于1小時)；2)依賴于核酸序列的擴增(NASBA)法，利用三種酶(逆轉錄酶、RNaseH和T7 RNA聚合酶)和兩個特異性引物的引導，在一恒定溫度下溫育45-90分鐘，即可完成對RNA模板的快速擴增，同時利用熒光基團標記的發夾型核酸探針進行檢測；3)滾環擴增技術(RCA)，利用DNA連接酶和DNA聚合酶，以滾環復制的模式，從一條或多條引物處進行環形模板的鏈置換合成，從而可實現部分病毒的環狀基因組的擴增；4)重組酶聚合酶擴增技術(RPA)，是在由多種酶和蛋白的參與下，在恒溫條件下實現核酸指數擴增的技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，利用這三種酶的共同作用，實現在等溫環境下的擴增。

以上幾種技術都各有其內在缺陷，如LAMP法擴增一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內大多數實驗室不能嚴格分區，假陽性問題比較嚴重，并且其引物設計要求比較高，對于分型或點突變檢測常常不能滿足要求；RPA方法的酶組分較為復雜，對于點突變的檢測能力有限；RCA的反應時間偏長(4小時)，使其在應用方面特別是現場檢測中的優勢不甚明顯。

CRISPR(成簇的規律間隔的短回文重復序列)是含有多個短同向重復的基因座，其被發現存在于約40％已測序的細菌基因組中和90％已測序的古細菌基因組中。CRISPR作為原核的適應性免疫系統發揮功能，可提供針對入侵的外源核酸的獲得性抗性。外源DNA的短片段(稱為間隔區)整合在CRISPR重復序列之間的基因組中，作為CRISPR元件保留過去暴露的記憶。這些被留作記憶的間隔區以類似于真核生物中RNAi的方式用于識別和沉默外來遺傳物質。Cas蛋白(CRISPR相關蛋白)是CRISPR系統中一種重要的蛋白質成分。