[發(fā)明專利]基于CRISPR-Cas的等溫核酸檢測方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811001245.0
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN109055499B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓序;高曉慶;馬秀玲;施慧玲;段昆;歐陽川
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州杰毅生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

1.非診斷目的的基于CRISPR-Cas的等溫核酸檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從待檢測樣本中提取總核酸；

（2）將提取后的待檢核酸樣本加入含有酶混合液、向?qū)NA、RNA熒光探針和擴(kuò)增引物對的緩沖液中進(jìn)行等溫反應(yīng)；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H和RNA酶抑制蛋白，所述CRISPR-Cas核酸酶選自LbaCas13、LbuC13a、LwaCas13a、AspCas13b、BzoCas13b、CcaCas13b、PsmCas13b、PinCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PbuCas13b、PguCas13b、PigCas13b、PsaCas13b、RanCas13b、PspCas13b、EsCas13d或RspCas13d；所述向?qū)NA是用于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生向?qū)NA序列的雙鏈DNA分子；向?qū)NA的序列由RNA聚合酶序列和向?qū)NA序列組成；所述向?qū)NA在5’端具有T7序列，所述T7序列為TAATACGACTCACTATAGGG；

（3）利用酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)后的熒光信號，通過熒光信號來判斷待檢樣本中是否存在目標(biāo)核酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶選自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄酶選自MMLV或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA熒光探針為5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)、3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)的單鏈RNA分子。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增引物對為一對長度為15-30bp的DNA引物，其中一條引物上帶有T7啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增長度為100-500bp。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖液成分還包括 10-100mM 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，2-30mM氯化鎂，10-100mM氯化鉀，1-10mM二硫蘇糖醇，1-5mM NTP，1-5mMdNTP，1-5mM擴(kuò)增引物，5-10% 二甲基亞砜，0.1-1% 牛血清白蛋白；所述緩沖液pH值在6.5-8.0之間。

7.基于CRISPR-Cas的等溫核酸檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括酶混合液、向?qū)NA、RNA熒光探針、擴(kuò)增引物對和緩沖液；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H和RNA酶抑制蛋白；所述向?qū)NA在5’端具有T7序列，所述T7序列為TAATACGACTCACTATAGGG，所述CRISPR-Cas核酸酶選自LbaCas13、LbuC13a、LwaCas13a、AspCas13b、BzoCas13b、CcaCas13b、PsmCas13b、PinCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PbuCas13b、PguCas13b、PigCas13b、PsaCas13b、RanCas13b、PspCas13b、EsCas13d或RspCas13d。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述CRISPR-Cas核酸酶為LbaCas13，所述RNA聚合酶為T7 RNA聚合酶；所述逆轉(zhuǎn)錄酶為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；所述RNA熒光探針為5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)、3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)的單鏈RNA；所述擴(kuò)增引物對為一對長度為15-30bp的DNA引物，其中一條引物上帶有T7啟動(dòng)子序列。