[發明專利]一種特異性識別蛋白A的多克隆抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811000557.X
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN109182364A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 吳剛;謝勝平;易紅波
• 申請（專利權）人: 武漢百意欣生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K16/12;G01N33/68
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明涉及生物科學和檢測試劑技術領域，更具體地，涉及一種特異性識別蛋白A的多克隆抗體及其制備方法和應用。該方法首先通過對蛋白A的抗原表位分析，把可產生較強免疫原性位點的基因片段選擇合適的引物進行擴增，并采用該位點的氨基酸序列制備重組蛋白片段，用此片段免疫動物得到特異性針對該位點的抗體。在重組蛋白制備中采用大腸桿菌表達系統，能很好的保證重組蛋白的表達，表達產量高，有利于大批量的制備特異性識別蛋白A的多克隆抗體。本發明制備的特異性識別蛋白A的多克隆抗體可應用于定量檢測試驗樣品中Protein A的殘留水平，同時也便于Protein A純化介質制造商監測特定條件下Protein A的脫落特征。

技術領域

本發明涉及生物科學和檢測試劑技術領域，更具體地，涉及一種特異性識 別蛋白A的多克隆抗體及其制備方法和應用。

背景技術

蛋白A是葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)的簡稱，是一種 從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞壁中分離的蛋白質。蛋白A主要 有5個結合抗體的功能域，每個結構域大約由58個氨基酸殘基組成(1、Karen L.A，Julia D.B，EmilyS.S.aureus IgG-bindingproteins SpA and Sbi：Host specificity andmechanisms ofimmune complex formation，MolecularImmunology，2008，45： 1600-1611；2、逢少蕉，梁浩，宋淑亮，葡萄球菌蛋白A活性機制與現代應用， 生命的化學，2008，28卷第6期，748-751)。

在單克隆抗體藥物的純化過程中，以蛋白A為基礎的親合層析是廣泛應用 的純化方法之一，該方法中Protein A是通過共價偶聯方式結合于純化介質之上， 單克隆抗體可以有效的在此步驟中得到純化。然而，在蛋白A親合層析柱使用 過程中會有微量的蛋白A從層析柱上脫落下來。研究表明蛋白A可能對人體有 潛在的危害，它的生物學作用包括刺激人體多種細胞素(IFNγ，TNFα，IL-1 α，IL-1β，IL-2，IL-4)的釋放。此外如果抗體產品污染有Protein A也可能影 響免疫檢測的結果。因此用精確靈敏的方法來確證單克隆抗體藥物中蛋白A的 殘留處于一個較低的和穩定的水平是單克隆抗體藥物的質量標準之一。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本發明提出了一種特異性識別蛋白A的 多克隆抗體及其制備方法和應用，通過對蛋白A的抗原表位分析獲得可產生較 強免疫原性位點的基因片段，并進行PCR擴增、構建表達載體、免疫動物得到 特異性針對該位點的抗體。該抗體可應用于定量檢測試驗樣品中Protein A的殘 留水平。

為實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明的第一個目的在于提出一種特異性識別蛋白A的多克隆抗體的制備 方法，包括如下步驟：

(1)蛋白A抗原表位分析：通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白A 的重組表達，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

(2)將選定的目的片段的DNA通過PCR擴增后插入到表達載體構建含有 如SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的重組表達載體，將所述重組表達載體轉化大 腸桿菌感受態細胞獲得重組蛋白A抗原；

(3)將所述重組蛋白A抗原免疫動物，經血清分離純化獲得特異性識別蛋 白A的多克隆抗體。

進一步地，所述步驟(2)中PCR擴增的引物序列為SEQ ID No.2和SE Q ID No.3所示。

進一步地，所述步驟(2)中的表達載體為PET28a。

進一步地，所述大腸桿菌感受態為大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。