[發(fā)明專利]一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811000557.X
• 申請(qǐng)日: 2018-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN109182364A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳剛;謝勝平;易紅波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢百意欣生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K16/12;G01N33/68
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)蛋白A抗原表位分析：通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白A的重組表達(dá)，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

(2)將選定的目的片段的DNA通過PCR擴(kuò)增后插入到表達(dá)載體構(gòu)建含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞獲得重組蛋白A抗原；

(3)將所述重組蛋白A抗原免疫動(dòng)物，經(jīng)血清分離純化獲得特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的引物序列為SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的表達(dá)載體為PET28a。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌感受態(tài)為大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)得到的重組蛋白A抗原的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中重組蛋白A抗原免疫的動(dòng)物為母雞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述免疫母雞的具體方法為：取純化后的重組蛋白A抗原免疫待產(chǎn)母雞，連續(xù)免疫四次，間隔15-30天免疫一次，首免劑量500-600μg/只，以后每次免疫300-400μg/只，免疫四次之后第8天開始收集雞蛋，即為含重組特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的雞蛋。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，含特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的雞蛋進(jìn)行分離純化的具體步驟為：取雞蛋放入75％酒精中浸泡5分鐘，將其蛋殼敲碎取出蛋黃放在濾紙上吸附掉殘留蛋清，破除蛋黃上的細(xì)胞膜，然后按1：9用去離子水稀釋混勻，然后加入1％辛酸，在攪拌機(jī)上攪拌30min，調(diào)節(jié)pH至5.1，置4℃冰箱6h；取出8000g離心5min，上清用濾紙過濾；加入固體硫酸銨至終濃度為50％，4℃靜置1h，5 000g離心20min,棄上清；再用和卵黃加水之后相同體積的PBS溶解后，采用截留50KD分子量的膜包進(jìn)行超濾，獲高純度的重組特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體。

9.一種權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述特異性識(shí)別蛋白A的多克隆抗體的制備方法在試驗(yàn)樣品中蛋白A的定量檢測(cè)中的應(yīng)用。