[發(fā)明專利]正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810998108.2
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN109097335B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉衛(wèi)輝;馮亞星;任麗娜;溫旭東;王濤
• 申請（專利權(quán)）人: 劉衛(wèi)輝
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 成都頂峰專利事務(wù)所(普通合伙) 51224
• 代理人: 何紅信

1.一種正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)方法包括在正常肝干細(xì)胞中同時失調(diào)四種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合誘導(dǎo)出肝癌干細(xì)胞的步驟；所述四種轉(zhuǎn)錄因子分別為TG737、miR10b、miR200a和CD44；四種轉(zhuǎn)錄因子的具體失調(diào)方式分別為沉默TG737、過表達(dá)miR10b、沉默miR200a和過表達(dá)CD44；所述正常肝干細(xì)胞為WB-F344。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)方法的具體步驟包括：

A、構(gòu)建可誘導(dǎo)慢病毒載體系統(tǒng)，得到慢病毒載體；

A1、構(gòu)建短發(fā)夾shRNA可誘導(dǎo)慢病毒載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子為TG737和miR200a，得到短發(fā)夾shRNA可誘導(dǎo)慢病毒載體；

A2、構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1可誘導(dǎo)慢病毒載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子為miR10b和CD44，得到真核表達(dá)載體pcDNA3.1可誘導(dǎo)慢病毒載體；

B、將步驟A1和A2得到的慢病毒載體以組合形式感染正常肝干細(xì)胞，挑選形態(tài)類似肝癌干細(xì)胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合肝癌干細(xì)胞特性的細(xì)胞克隆，得到肝癌干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：還包括步驟C、肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)：

C1、培養(yǎng)：將步驟B的肝癌干細(xì)胞采用Williams's E培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到培養(yǎng)后肝癌干細(xì)胞；

C2、轉(zhuǎn)染：將培養(yǎng)后肝癌干細(xì)胞用加入了慢病毒載體的聚凝胺-基質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)染肝癌干細(xì)胞；

C3、克隆：將轉(zhuǎn)染肝癌干細(xì)胞用完全培養(yǎng)基依次進(jìn)行培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)后，得到傳代肝癌干細(xì)胞；

C4、藥物篩選：從傳代肝癌干細(xì)胞中藥物篩選出肝癌干細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述步驟C1的具體步驟是：步驟B的肝癌干細(xì)胞在12孔板中，以2×10⁵個肝癌干細(xì)胞/孔，每孔加入1mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的FBS的Williams's E培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述步驟C2中培養(yǎng)后肝癌干細(xì)胞的密度為肝癌干細(xì)胞飽和密度的50-70％；所述步驟C2中慢病毒載體為步驟A1和A2得到的慢病毒載體以組合形式攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體；慢病毒載體的加入量為10ug/孔；聚凝胺-基質(zhì)培養(yǎng)基的加入量為1mL/孔，每空中聚凝胺的最終濃度為5ug/mL；所述步驟C2的培養(yǎng)時間為12h。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述步驟C3的培養(yǎng)的時間為12h；傳代培養(yǎng)的時間為48h；傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)染肝癌干細(xì)胞的比例為1:3。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的正常肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述藥物篩選的藥物為嘌呤霉素二鹽酸鹽，所述嘌呤霉素二鹽酸鹽在每孔中最終的濃度為10ug/mL。