[發(fā)明專利]一種豬病原體的多重PCR檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810997511.3
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN109439775A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設計）人: 曾澤;張華琦;桂干北;綦世金
• 申請（專利權(quán)）人: 銅仁職業(yè)技術(shù)學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/46;C12R1/35;C12R1/10
• 代理公司: 貴陽睿騰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 52114
• 代理人: 谷慶紅

本發(fā)明公開了一種豬病原體的多重PCR檢測方法，包括待測樣本DNA提取、PCR反應、PCR擴增、擴增產(chǎn)物電泳檢測、電泳檢測結(jié)果分析等步驟，PCR反應的體系為：Buffer2.5μL；Mg²⁺1.5μL；dNTP2μL；SS上下游引物各0.5μL；HPS上下游引物各0.5μL；Mph上下游引物各0.5μL；Taq酶0.25μL；模板2μL；無菌去離子水補足至25μL。豬病原體的常規(guī)檢測方法相對費時、費力，不利于檢測工作的高效開展，基于需快速、準確診斷混合感染病原的目的，利用多重PCR檢測的諸多優(yōu)點，建立豬病原體快速、特異和靈敏的多重PCR診斷方法，達到對這幾種疾病快速、準確而靈敏的檢測和診斷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原體的基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬病原體的多重PCR檢測方法。

背景技術(shù)

豬呼吸道疾病是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病癥候群之一，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和養(yǎng)殖規(guī)模的不規(guī)范，使得豬呼吸道疾病日趨流行，危害日漸嚴重，給世界養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)和豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是引起豬呼吸道疾病的主要病原體，分別引起豬的鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病和支原體肺炎，導致豬呼吸道的急慢性炎癥，嚴重時會引起豬死亡。在豬群中，這些病原菌之間的混合感染十分普遍，不僅提高了豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度，也增加了豬疾病的復雜性和診斷難度。

目前，實驗室常用的病原檢測方法有病原菌分離、血清學方法、免疫學方法和PCR方法等，其中病原菌分離和PCR方法最常見。但是，病原菌的分離費事費力，不利于采取措施進行及時治療，敏感性不高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且HPS和Mhp的體外培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢，容易死亡，容易導致漏檢。血清學和免疫學方法因為抗體變化沒有規(guī)律容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。多重PCR是一種利用多條特異性引物在單管PCR反應體系中同時擴增出多個目的核酸片段的方法，具有操作簡單、快速、特異性和敏感度高等優(yōu)點，特別適合用于混合感染的大量臨床樣本的快速診斷。因此，建立SS、HPS和Mph的多重PCR診斷方法，以達到對這幾種疾病進行快速、準確而靈敏的檢測和診斷，為這幾種病的防治提供科學依據(jù)，而且這對提高動物疫病的檢測、監(jiān)控水平和保障動物源性食品安全具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，提供了一種豬病原體的多重PCR檢測方法。由于豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和豬肺炎支原體可同時感染豬，常規(guī)的檢測方法相對費時、費力，檢測成本較高，不利于檢測工作的高效開展，基于需要快速、準確診斷混合感染病原的需要，本發(fā)明提供一種快速、特異、敏感的豬病原多重PCR檢測方法，可同時對豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和豬肺炎支原體3種病原單個或多個混合感染的臨床樣品進行鑒別診斷，也可用于這3種病原的分子流行病學調(diào)查，降低了檢測成本，減輕了檢測人員的勞動強度。

為了能夠達到上述所述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種豬病原體的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

(1)待測樣本DNA提取：采用DNA提取試劑盒提取豬組織待測樣本的DNA，然后置于-20℃環(huán)境下，備用；

(2)PCR反應：將提取得到的豬組織待測樣本DNA加入反應管中，用渦旋儀將PCR反應管中液體混勻后瞬時離心；

(3)PCR擴增：將上述PCR反應管置于PCR儀中進行擴增；

(4)擴增產(chǎn)物電泳檢測：PCR擴增反應終止后，取6μL的PCR擴增產(chǎn)物與溴酚藍上樣緩沖液混合，用移液器依次加入加樣孔內(nèi)，在1％瓊脂糖凝膠中進行恒壓電泳，電泳完成后，將凝膠取出放入凝膠成像系統(tǒng)中進行拍照；