[發(fā)明專利]一種豬病原體的多重PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810997511.3
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN109439775A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾澤;張華琦;桂干北;綦世金
• 申請（專利權(quán)）人: 銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/46;C12R1/35;C12R1/10
• 代理公司: 貴陽睿騰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 52114
• 代理人: 谷慶紅

1.一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)待測樣本DNA提取：采用DNA提取試劑盒提取豬組織待測樣本的DNA，然后置于-20℃環(huán)境下，備用；

(2)PCR反應(yīng)：將提取得到的豬組織待測樣本DNA加入反應(yīng)管中，用渦旋儀將PCR反應(yīng)管中液體混勻后瞬時離心；

(3)PCR擴增：將上述PCR反應(yīng)管置于PCR儀中進行擴增；

(4)擴增產(chǎn)物電泳檢測：PCR擴增反應(yīng)終止后，取6μL的PCR擴增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，用移液器依次加入加樣孔內(nèi)，在1％瓊脂糖凝膠中進行恒壓電泳，電泳完成后，將凝膠取出放入凝膠成像系統(tǒng)中進行拍照；

(5)電泳檢測結(jié)果分析：將標(biāo)本孔出現(xiàn)的電泳帶與陽性對照和陰性對照進行對比，判定被檢樣本為副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌和豬肺炎支原體3種病原體陽性或陰性；如果電泳檢測出現(xiàn)822bp、689bp、351bp的目的條帶，則判定為HPS、SS或Mhp陽性，說明待測樣本中含有副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌或豬肺炎支原體；如果沒有目的條帶，則判定為陰性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于：在步驟(1)，DNA提取的方法按照DNA提取試劑盒說明書進行。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于：在步驟(2)，所述PCR反應(yīng)的體系為：Buffer2.5μL；Mg²⁺1.5μL；dNTP2μL；SS上下游引物各0.5μL；HPS上下游引物各0.5μL；Mph上下游引物各0.5μL；Taq酶0.25μL；模板2μL；無菌去離子水補足至25μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于：所述引物序列為：擴增SS基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；擴增HPS基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；擴增Mph基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于：所述模板為豬組織待測樣本提取得到的DNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于：在步驟(3)，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃終延伸10min；4℃保存。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬病原體的多重PCR檢測方法，其特征在于：在步驟(4)，所述電泳條件為100mA、200V，電泳時間為30min。