[發明專利]一種DNA甲基化程度的定量方法及應用

在審

• 申請號: 201810997175.2
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN109022556A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 羅敏;趙勇娟;韓玥斌;劉煥
• 申請（專利權）人: 天津智魚生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種DNA甲基化程度的定量方法及應用，所述方法包括以下步驟：(1)將亞硫酸鹽修飾的DNA加入PCR體系，進行數字PCR；(2)根據DNA的甲基化拷貝數和非甲基化拷貝數，得到DNA的甲基化程度；其中，步驟(1)所述PCR體系包括Taqman探針，所述Taqman探針包括甲基化Taqman探針或非甲基化Taqman探針。本發明的方法將亞硫酸鹽修飾的目的基因分別采用甲基化探針和非甲基化探針進行檢測，基于數字PCR準確定量出待檢測基因的甲基化拷貝數和非甲基化拷貝數，實現了對目的基因甲基化程度的絕對定量，適用于血液樣本中微量ctDNA的檢測，靈敏度高、特異性強、精準快捷，有利于在液體活檢技術領域中的推廣。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種DNA甲基化程度的定量方法及應用。

背景技術

惡性腫瘤已成為致死率最高的疾病之一，盡管已有多種手段用于腫瘤的治療，但患者的預后往往與腫瘤的分期相關，晚期腫瘤的預后效果較差。世界衛生組織(WHO)指出：腫瘤的早期診斷與治療有利于將治愈率提高到80％。然而多數癌癥早期無明顯癥狀，發展快且易轉移，發現時已是中晚期，臨床治療效果不佳。目前臨床應用的早期篩查方法包括血清學腫瘤蛋白標志物檢測或影像學監測，但存在靈敏度低或滯后的缺點。目前，臨床上還缺乏有效的腫瘤早期檢測方法。

循環腫瘤DNA也稱為ctDNA，是從腫瘤細胞釋放到血液循環系統中的游離DNA片段。ctDNA的濃度與腫瘤的進展高度相關，可以用于腫瘤分期、預后評估和動態監測。ctDNA液體活檢是指針對ctDNA進行基因組學、轉錄組學和表觀遺傳學等方面的檢測，該方法不僅取樣簡單，還能全面反應腫瘤細胞的基因信息，可用于無創式腫瘤早期篩查、輔助診斷分型、用藥指導和預后判定。

DNA分子中CpG位點的甲基化是調節基因表達的重要因素。研究發現，與正常細胞相比，腫瘤細胞呈現出基因組甲基化水平低、抑癌基因啟動子CpG島甲基化水平高的趨勢。在腫瘤發生的早期，同一類型的腫瘤細胞具有穩定一致的特征性DNA甲基化改變，導致相應的抑癌基因失活，因此血液中游離的甲基化DNA可作為腫瘤早期診斷的標志物。

近年來大量研究表明，在肺癌、結直腸癌和肝癌等多種癌癥中，甲基化ctDNA與腫瘤的早期診斷和預后監測密切相關，具有重要的臨床價值。一項大型研究從全基因組水平上對肝癌組織和正常血液DNA中的485,000個CpG位點的甲基化水平進行了比較，篩選出差異性顯著的位點，對近兩千例肝癌和正常人血漿中的ctDNA進行了甲基化PCR擴增和測序，分別篩選出10個和8個位點建立了診斷模型和生存預后模型。該診斷模型在訓練組715例肝癌患者和560例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達到了85.7％和94.3％，在驗證組383例肝癌患者和275例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達到了83.3％和90.5％，均明顯高于肝癌血清標志物AFP。并且，該模型能準確區分肝癌患者和慢性肝炎(HBV/HCV)與脂肪肝患者，顯示出甲基化ctDNA檢測在肝癌早期診斷中的巨大價值。

傳統的甲基化檢測方法包括甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸鹽處理+測序、聯合亞硫酸鹽的限制性內切酶法(COBRA)、焦磷酸測序和熒光定量PCR。其中，基于測序的檢測結果往往被作為參考標準，但是ctDNA的片段較短，測序結果的誤差較大；內切酶法可以進行甲基化的定性分析，但無法實現定量分析；熒光定量PCR法簡單便捷，但對于微量樣本，檢測結果精確性差，靈敏度低。傳統方法的缺陷限制了其在臨床中的應用。

與熒光定量PCR不同，數字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數，具有比傳統qPCR更加出色的靈敏度、特異性和精確性。其中，微滴式數字PCR(ddPCR)可確定單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，成本低，實用性強。