[發明專利]一種抗凝血的DNA納米復合結構及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810995000.8
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN110551725B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 丁寶全;趙帥;蔣喬;劉少利
• 申請（專利權）人: 國家納米科學中心
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;A61K31/711;A61P7/02
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種抗凝血的DNA納米復合結構及其制備方法和應用，所述DNA納米復合結構包括DNA納米結構和抗凝血酶核酸適配體，所述DNA納米結構由DNA模板鏈、輔助折疊DNA鏈和捕獲DNA鏈組裝而成，所述抗凝血酶核酸適配體通過捕獲DNA鏈結合在DNA納米結構表面；本發明首先自組裝得到DNA納米結構，并通過位點設計將兩種抗凝血酶適配體短DNA鏈組裝到長方形DNA結構表面，精準控制適配體的相對位置，協同起效，優化組裝和制備方法，最終得到DNA納米復合結構，能有效抑制凝血酶活性，并能夠利用與核酸適配體互補DNA短鏈使其快速解毒，具有廣闊的應用前景和市場價值。

技術領域

本發明涉及納米藥物技術領域，尤其涉及一種抗凝血的DNA納米復合結構及其制備方法和應用。

背景技術

凝血酶通過識別多種超分子底物發揮凝血的功能，是生物體凝血系統的一種關鍵酶。在不需要其它眾多凝血因子參與的情況下，凝血酶能夠快速而高效的誘導血栓的形成。凝血酶可識別可溶性纖維蛋白原，使之轉變為不可溶解的纖維蛋白，還可誘導血小板活化，使之在纖維蛋白凝膠網的作用下形成血小板血栓。凝血酶發揮功能時需要識別特定底物，其表面具有兩個特異性識別位點，分別是纖維蛋白原識別位點(Fibrinogen-recognitionexosite)和肝素識別位點(Heparin-binding exosites)。

抗凝血酶核酸適配體是一類核酸序列，其二級結構為G四聯體(G-quadruplex)，能夠特異性識別凝血酶的外識別位點(exosites)。這些適配體序列由指數富集的配基系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by ExponentiaL Enrichment，SELEX)篩選得到，其中TBA15和HD22最為著名。L.C.Bock,J.J.Toole及其同事于1992年利用SELEX技術得到第一條抗凝血酶核酸適配體TBA15，這條單鏈DNA序列(5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3')形成的二級結構能夠特異性識別前述纖維蛋白原識別位點(the fibrinogen-recognitionexosite)，通過抑制纖維蛋白原活化和血小板聚集從而抑制凝血酶活力。Gilead Sciences公司在1997年發現第二條抗凝血酶核酸適配體HD22(5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3')，通過識別肝素結合位點(heparin-bindingexosites)，通過抑制V/VIII因子活化從而抑制凝血酶活力。這兩種抗凝血酶核酸適配體都具有較高的親和性和良好的特異性，已在各種基于核酸適配體的診斷和治療中發揮作用，已有臨床試驗研究。同時，不同于其他抗凝劑，核酸適配體藥物為核酸本質，可利用互補序列對其進行快速解毒，從而減少或避免其出血風險。然而，雖然已有許多優勢，核酸適配體在實際應用中仍然存在諸多的問題，如核酸序列在體液內穩定性較差、很容易被降解、被腎臟代謝清除，限制其進一步應用。

在納米醫學領域中，DNA納米技術展現了廣泛的應用潛能。其中DNA折紙技術(DNAorigami)作為一種全新的DNA自組裝策略引起研究者廣泛的關注。在DNA折紙技術中，通過將一條DNA長單鏈(模板鏈，Scaffold strand)與一系列預先設計的DNA短單鏈(輔助折疊鏈，Helper strands)共同退火自組裝，可構造出多種多樣復雜可控的納米圖案或結構(Nature,2006,440,297-302)。DNA納米材料具有結構精確可控、易于化學修飾、生物可降解等特點，是一種很有潛力的納米載體材料，在藥物靶向運輸、可控釋放、多種藥物協同運輸治療、智能藥物體系構建等方面有非常廣闊的應用前景。

為了提升核酸適配體在活體內的穩定性和長循環，目前已有對于適配體序列進行化學修飾后進行應用的報道。然而，雖然序列修飾使得適配體的熱穩定性得到提升，但卻不可避免的影響其抗凝活力。利用納米顆粒修飾核酸適配體，則可提升核酸適配體的穩定性，已被用于靶向配體的篩選或檢測探針研究，但結合其核酸適配體生物功能，應用于醫學實踐的報道則非常稀少。