[發(fā)明專利]一種斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810994759.4
• 申請(qǐng)日: 2018-08-29
• 公開（公告）號(hào): CN110872573B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳楨玥;王秋云;席其良;陸國(guó)平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 上海元好知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31323
• 代理人: 劉琰

1.一種斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，其包含以下步驟：

步驟1：將斑馬魚用A1溶液進(jìn)行清洗以去除雜物，然后用乙醇洗滌；

步驟2：處死斑馬魚，并快速取出斑馬魚心臟；

步驟3：將取出的心臟用A2溶液進(jìn)行洗滌除菌；

步驟4：用剪刀精細(xì)切碎心臟，用細(xì)胞培養(yǎng)液A3吹打成單細(xì)胞懸液；

步驟5：將單細(xì)胞懸液離心后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液A3，加入細(xì)胞培養(yǎng)液A4進(jìn)行培養(yǎng)；

所述A1溶液的配制方法為：取0.17-0.37g磷酸二氫鉀、1.32-1.52g磷酸氫二鈉、7-9g氯化鈉和0.1-0.3g氯化鉀，混合后加700-900mL去離子水?dāng)嚢枞芙猓尤霛恹}酸調(diào)pH至7-8后定容到1L，最后添加80-120單位/mL青霉素與80-120μg/mL鏈霉素；

所述A2溶液的配方為青霉素與鏈霉素濃度加倍的A1溶液；

所述細(xì)胞培養(yǎng)液A3的配方為：DMEM完全培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為8％-12％的胎牛血清、80-120單位/mL青霉素與80-120μg/mL鏈霉素；

所述細(xì)胞培養(yǎng)液A4的配方為：DMEM完全培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為2％-8％的馬血清、8-12μmol/L的阿糖胞苷；0.05-0.15mmol/L的brdu、1-3μg/ml的絲裂霉素C、80-120單位/mL青霉素與80-120μg/mL鏈霉素；其中，brdu和絲裂霉素C只在原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)過程的前24小時(shí)加入；

所述斑馬魚為以14小時(shí)光照及10小時(shí)黑暗的光循環(huán)在溫度為28.5℃的水環(huán)境中飼養(yǎng)，并在不同飼養(yǎng)群中隨機(jī)選擇的15-18個(gè)月齡的成魚。

2.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，所述A1溶液的配制方法為：取0.27g磷酸二氫鉀、1.42g磷酸氫二鈉、8g氯化鈉和0.2g氯化鉀，混合后加800mL去離子水?dāng)嚢枞芙猓尤霛恹}酸調(diào)pH至7.4后定容到1L，最后添加100單位/mL青霉素與100μg/mL鏈霉素。

3.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液A3的配方為：DMEM完全培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清、100單位/mL青霉素與100μg/mL鏈霉素。

4.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液A4的配方為：DMEM完全培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為5％的馬血清、10μmol/L的阿糖胞苷；0.1mmol/L的brdu、2μg/ml的絲裂霉素C、100單位/mL青霉素與100μg/mL鏈霉素。

5.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，步驟1中至少用A1溶液清洗斑馬魚3遍；步驟3中至少用A2溶液清洗心臟5遍。

6.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，步驟2中，將斑馬魚置于冰水中處死。

7.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，步驟5中，在加入細(xì)胞培養(yǎng)液A4前，用細(xì)胞培養(yǎng)液A3再洗一遍并重復(fù)離心一次，進(jìn)而再棄去細(xì)胞培養(yǎng)液A3。

8.如權(quán)利要求1所述的斑馬魚原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的新方法，其特征在于，所述A1溶液、A2溶液、細(xì)胞培養(yǎng)液A3及細(xì)胞培養(yǎng)液A4制備后進(jìn)行過濾除菌。