[發明專利]一種斑馬魚原代心肌細胞分離與培養的新方法

有效

• 申請號: 201810994759.4
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN110872573B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 陳楨玥;王秋云;席其良;陸國平
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海元好知識產權代理有限公司 31323
• 代理人: 劉琰

本發明公開了一種斑馬魚原代心肌細胞分離與培養的新方法，其包含以下步驟：步驟1：將斑馬魚用A1溶液進行清洗以去除雜物，然后用乙醇洗滌；步驟2：處死斑馬魚，并快速取出斑馬魚心臟；步驟3：將取出的心臟用A2溶液進行洗滌除菌；步驟4：用剪刀精細切碎心臟，用細胞培養液A3吹打成單細胞懸液；步驟5：將單細胞懸液離心后棄去細胞培養液A3，加入細胞培養液A4進行培養。本發明平均一個斑馬魚心臟能夠得到約9.2×10⁵個原代心肌細胞。可進一步用于研究心臟發育與再生功能、疾病機制研究，也可以應用于篩選小分子藥物。本方法效率高、經濟、方便；分離的斑馬魚原代細胞具有功能性；經免疫熒光鑒定，純度達到95％以上。

技術領域

本發明涉及細胞分離與培養技術領域，具體涉及一種斑馬魚原代心肌細胞分離與培養的新方法。

背景技術

心血管疾病是導致人類死亡的最主要原因之一，并且呈逐年上升趨勢。心肌細胞凋亡或者生長抑制可導致心肌功能障礙，甚至機體死亡。心肌再生是目前心血管疾病研究中的熱點問題。心臟組織工程研究通過永生化心肌細胞、胚胎或胎兒及新生兒的細胞模型以及誘導不同來源干細胞定向分化為心肌細胞來解決心肌細胞自我更新和再生能力有限等問題，為心肌再生提供了新的治療策略；但是種種研究方法所產生的心肌細胞并沒有成體細胞的全部功能。心肌細胞是永久分化細胞，在體外培養難度極大，目前常用的模擬心肌細胞(例如H9C2細胞)具有心肌細胞的部分活性但并非真正的心肌細胞；因此發明高效的成體心肌細胞體外培養新方法有助于解決目前心血管研究領域中真實心肌細胞難以體外培養的重大難題。

斑馬魚(Danio rerio)胚胎在體外發育且通體透明，遺傳背景與人類高度同源，廣泛用于發育學研究。但人類心血管疾病大部分在成體發病，因此近年來斑馬魚成體模型逐漸興起。現階段，胚胎斑馬魚為模型的研究主要集中在心臟發育與再生方面。在成體模型方面，由于斑馬魚體型小，心臟組織少，心肌細胞原代培養困難，限制了成體斑馬魚心血管疾病模型的應用和相關機制的研究。目前的斑馬魚原代心肌細胞分離方法效率低，得到的原代心肌細胞數量十分有限；同時，原代細胞的傳代數量限制，在很大程度上限制了斑馬魚心肌細胞系的應用前景。體外心肌細胞培養方法學的構建困難，使得成體斑馬魚心肌細胞的體外研究有較大的局限性，也因此成為斑馬魚心血管疾病的成體模型的建立和研究并未得到廣泛開展的重要原因之一。本發明大大提高了斑馬魚成體心臟的心肌原代培養效率和質量，突破了斑馬魚模型研究的瓶頸。

發明內容

本發明的目的是提供一種斑馬魚原代心肌細胞分離與培養的新方法，以解決現有斑馬魚原代心肌細胞分離與培養方法的缺點與不足，為斑馬魚原代心肌細胞的研究與應用提供工具細胞。

為達到上述目的，本發明提供了一種斑馬魚原代心肌細胞分離與培養的新方法，其包含以下步驟：

步驟1：將斑馬魚用A1溶液進行清洗以去除雜物，然后用乙醇洗滌；

步驟2：處死斑馬魚，并快速取出斑馬魚心臟；

步驟3：將取出的心臟用A2溶液進行洗滌除菌；

步驟4：用剪刀精細切碎心臟，用細胞培養液A3吹打成單細胞懸液；

步驟5：將單細胞懸液離心后棄去細胞培養液A3，加入細胞培養液A4進行培養；

所述A1溶液的配制方法為：取0.17-0.37g磷酸二氫鉀、1.32-1.52g磷酸氫二鈉、7-9g氯化鈉和0.1-0.3g氯化鉀，混合后加700-900mL去離子水攪拌溶解，加入濃鹽酸調pH至7-8后定容到1L，最后添加80-120單位/mL青霉素與80-120μg/mL鏈霉素；

所述A2溶液的配方為青霉素與鏈霉素濃度加倍的A1溶液；

所述細胞培養液A3的配方為：DMEM完全培養基、體積分數為8％-12％的胎牛血清、80-120單位/mL青霉素與80-120μg/mL鏈霉素；