[發(fā)明專利]快速檢測人類Y染色體微缺失的多重PCR引物組、試劑盒和應用

在審

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• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN108998516A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 李曉輝;徐素茹;覃彩種;韋秋燕
• 申請（專利權）人: 廣州達暉生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 佛山幫專知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 顏春艷

本發(fā)明提供一種快速檢測人類Y染色體微缺失的多重PCR引物組、試劑盒和應用，可同時擴增Y染色體上6個STS基因位點和內(nèi)參基因SRY；每個STS位點都含有特異性擴增的PCR引物和特異性擴增的RCR巢式引物。所述試劑盒包括PCR反應液Ⅰ、PCR反應液Ⅱ、正常男性基因組DNA、正常女性基因組DNA以及0.1×TE buffer。本發(fā)明建立的試劑盒，同時優(yōu)化了多重熒光定量PCR的擴增效率，有效的抑制二聚體，提高多重PCR體系引物的容納數(shù)量，還可以減小各個基因擴增效率的差異，促使擴增均衡、高效和穩(wěn)定。

技術領域

本發(fā)明屬于基因缺失檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測人類Y染色體微缺失的多重PCR引物組、試劑盒和應用。

背景技術

Y染色體微缺失在造成男性不育癥的遺傳因素中居第二位，發(fā)生率僅次于克氏綜合征。一般人群Y染色體微缺失發(fā)生率為1/4,000，但在不育男性中顯著升高。目前Y染色體微缺失已成為無精、少精和弱精患者的常規(guī)檢測項目。在少精子癥或無精子癥男性中發(fā)現(xiàn)的Y染色體微缺失區(qū)域，主要是無精子因子(azoospermia factor，AZF)區(qū)域包含AZFa、AZFb、AZFc區(qū)。歐洲男科學協(xié)會和歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控協(xié)作網(wǎng)(EAA/EMQN)2004年發(fā)表“Y染色體微缺失分子診斷指導意見”建議通過對各AZF區(qū)的共6個STS位點檢測Y染色體微缺失每個區(qū)域檢測2個STS，分別為AZFa檢測sY84和sY86，AZFb檢測sY127和sY134，AZFc檢測sY254和sY255，若每個區(qū)域的2個STS發(fā)生缺失時，則代表該區(qū)域發(fā)生缺失，并指出以上6個STS能檢測出超過95％的AZF缺失。

現(xiàn)有產(chǎn)品應用最為廣泛的方法為多重PCR-瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳檢測靈敏度和分辨率不高，容易出現(xiàn)PCR產(chǎn)物污染造成假陽性，產(chǎn)物量較少時條帶不易判別容易出現(xiàn)假陰性，不利于臨床結果的判斷，且操作較為復雜，耗時長。其它的一些檢測方法如基因芯片、測序法，毛細管電泳法，雖然具有高通量、高精確性等特點，但技術要求高，儀器設備昂貴，不利于推廣。

目前，已有多重熒光定量PCR檢測Y染色體微缺失，例如中國專利申請CN102876776A公布了檢測Y染色體微缺失的實時熒光定量PCR試劑盒及方法，該方法只是采用多重熒光定量PCR技術檢測Y染色體微缺失；中國專利申請CN102703578A也公布了Y染色體微缺失多重實時熒光PCR檢測試劑盒，該試劑盒采取多重熒光定量PCR技術結合同源加尾引物(HAND引物)，抑制引物二聚體的產(chǎn)生，但存在多個靶點擴增條件不兼容的問題。

因此，急需一種既能抑制引物二聚體產(chǎn)生，又能解決多重PCR技術多個靶點擴增條件不兼容的難點的檢測方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種快速檢測人類Y染色體微缺失的多重PCR引物組、試劑盒和應用，通過運用多重熒光PCR技術結合同源加尾系統(tǒng)(Homo-Tag AssistedNon-Dimer system,HAND)和靶序列富集多重PCR技術(target enriched multiplex PCR，Tem-PCR)，實現(xiàn)抑制引物二聚體產(chǎn)生，又能解決多重PCR技術多個靶點擴增條件不兼容的難題，提高檢測靈敏度，具有快速、低成本、高準確度、高敏感性、穩(wěn)定性和均一性的優(yōu)點。

為解決上述問題，

一方面，本發(fā)明在于提供一種快速檢測人類Y染色體微缺失的多重PCR引物組，所述多重PCR引物組包括通用引物和特異性引物，可同時擴增6個與Y染色體微缺失檢測相關的位點和內(nèi)參基因：

所述通用引物具有如SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的堿基序列；

所述6個與Y染色體微缺失檢測相關的位點包括：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255位點；

所述內(nèi)參基因為SRY；