[發明專利]煙草eIF4E-1突變位點特異性共顯性分子標記及其應用

有效

• 申請號: 201810989309.6
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN108866234B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 林世鋒;王仁剛;余婧;任學良;張潔;余世洲
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 張行超

本發明公開了一種煙草eIF4E?1突變位點特異性共顯性分子標記，與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM?W，片段大小543bp，如SEQ ID No.1所示；對應的堿基插入突變位點檢測相關的標記命名為ASM?m，片段大小543bp，如SEQ ID No.2所示。本發明還公開了一種用于鑒別上述突變位點特異性共顯性分子標記的引物，引物序列如SEQ ID NO.3、4、5所示。利用該標記和引物可以對PVY抗性供體親本的回交轉育后代的基因型進行準確選擇。本發明的標記和引物可以作為分子標記應用于煙草種質資源鑒定和育種輔助選育，選擇含有開陽小黑煙eIF4E?1突變類型的種質材料或轉育后代。

技術領域

本發明涉及一種基因的突變體及其相關位點特異性分子標記的開發，尤其涉及一種煙草真核生物翻譯起始因子eIF4E-1的突變及其位點特異性分子標記開發和應用。突變體能夠為選育含該突變位點的抗病毒煙草種質提供變異源，位點特異分子標記能夠直接應用于分子標記輔助育種來選擇含有該突變位點的煙草材料，提高eIF4E-1突變體的選擇效率，屬于生物技術領域。

背景技術

煙草馬鈴薯Y病毒病，又稱為脈斑病，是由馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的一種煙草系統性侵染病害。此病引起的損失因煙草侵染時期和病毒株系不同而異，早期感染的脈壞死株系，可導致絕產絕收，若近收獲期感染或感染弱株系，則減產相對較輕，一般損失25-45％。PVY除引起產量損失外，更為嚴重的是病葉烤曬后色澤和煙味較差，品質顯著降低。

選育抗PVY的煙草品種是防治該病最經濟有效的方法。為選育抗病品種，國內外鑒定出多個抗PVY的種質資源，如VAM、V.SCR等，并育成抗病白肋煙品種TN86、TN90和烤煙品種NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表現為隱性基因(va)控制，是由于對PVY感病的基因缺失造成的。并開發出與Va位點相關的分子標記(RAPD、SCAR)。烤煙種質RY5對PVY壞死株系(PVYN)的抗性符合孟德爾一對隱性基因控制的質量性狀的遺傳模型，已報道與抗病基因對應的顯性等位基因位點(Va)緊密連鎖的RAPD標記O12V3695與SCAR標記PVY ME1。文獻報道的RAPD標記和SCAR標記，與PVY抗性的連鎖距離分別為2.10cM和2.52cM。與PVY抗性的連鎖距離較遠，將導致利用標記數據判斷抗性表型誤差較大。同時RAPD標記存在擴增產物的特異性不高，非目標條帶干擾結果判斷、PCR擴增需要循環數多達45個循環等不足。

已有研究表明eIF4E為Va基因位點的一個隱性抗PVY基因，即感PVY基因。2014年，國外學者采用新一代測序技術比較煙草抗感PVY近等基因系轉錄組，明確了煙草eIF4E-1基因(GenBank登錄號KF155696)為煙草PVY隱性抗病基因。2015年，云南省煙草農業科學研究院劉勇等根據煙草eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，開發出一個與PVY抗性緊密連鎖的顯性分子標記(專利申請號：2014101504706)，其通過在煙草野生型eIF4E-1基因的第1個外顯子內設計上游引物(CF2)，在內含子區域設計下游引物(GR11)，獲得在供試抗病品種中無擴增條帶，而在感病品種中有特異條帶的引物對。該標記能將部分抗病烤煙(或白肋煙)品種與感病品種區分開來，但不能有效區分野生型eIF4E-1的純合和雜合基因型，例如申請人通過序列分析和PCR驗證，發現應用CF2/GR11引物在6份PVY抗病曬煙品種和8份PVY感病烤煙或曬煙品種中均能擴增出大約的特異性條帶(如圖1所示)，因此其不能有效地將這些煙草PVY抗感品種區分開來，在回交轉育突變型eIF4E-1位點時，不能直接利用該分子標記進行輔助選擇。

發明內容

為克服現有分子標記的不足，本發明針對獲得的一個eIF4E-1位點的堿基插入突變體提出一種鑒定煙草PVY抗性的分子標記，根據突變位點的序列特點，設計引物，開發了鑒定野生型和突變體的共顯性標記并用于標記輔助選擇。利用本發明的煙草PVY隱性抗病基因的分子標記進行輔助選擇育種，對加快育種進程和提高我國煙草育種水平起到促進作用。