[發(fā)明專利]一種特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒及其制備方法

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• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN109125738A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設計）人: 魏坤;羅逍;萬淑倩;牛雪明;莫燦龍
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: A61K47/69
• 分類號: A61K47/69;A61K47/54;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強

本發(fā)明公開了特異性核酸適配體鍵合的PEG?PLGA納米粒的制備方法。該納米粒成功將生物分子與高分子材料相結合，將高分子材料進行改性，使不具備靶向性的納米粒帶有主動靶向性。在本方法中，我們使用末端具有羧基的PEG?PLGA納米粒，在EDC/NHS交聯劑的反映狀況下，將具有CD30靶向功能的核酸適配體連接在高分子納米粒上。本發(fā)明方法能夠使易被體液分解的核酸適配體通過共價鍵鍵合在高分子納米粒上，使核酸適配體與納米粒高效連接，達到理想的靶向作用。

技術領域

本發(fā)明屬于化學藥物技術領域，涉及一種使生物分子核酸適配體成功鍵合在高分子材料上的方法，使高分子納米粒具有主動靶向性的制備方法。

背景技術

適配體是一些寡核酸或肽，其對幾種類型的靶分子，包括蛋白質，核苷酸，肽，抗生素，小分子和細胞有高度的敏感性和良好的選擇性。小核酸適配體在嚴苛的條件下表現出良好的穩(wěn)定性，肽適配體具有與靶分子相互作用的合適結構。所有類型的適配體含有結合到靶分子的特定袋的可變環(huán)和莖區(qū)。適配體與抗體具有不同的優(yōu)點，包括較小的尺寸，易于修飾和在苛刻的物理和化學環(huán)境中的高穩(wěn)定性，以及快速和經濟的生產，無批次間變化，低免疫原性和高度可變性。因此，適配體在醫(yī)學目標和成像期間被認為是抗體的極好替代物，并且用于各種領域。核酸適配體的篩選技術被稱為指數富集的配體系統進化技術(SELEX)技術，原理是首先構建容量巨大的隨機寡核苷酸序列庫，然后經過多輪結合和洗脫，從中獲得能夠和靶標物質高度親和的寡核苷酸。SELEX是四個主要步驟的重復：與編碼隨機序列的適配體文庫，通常為30-50mer，和引物結合位點；結合文庫的洗脫；用聚合酶鏈反應擴增；和單鏈寡核苷酸分離。該過程通常重復10-15次，然后使用克隆技術分析所選擇的適配體候選物。

許多納米材料的開發(fā)加速了診斷和治療的進展。各種納米材料，如水凝膠，金屬納米顆粒，二氧化硅納米顆粒和碳材料，具有理想的特性，包括可控的物理和化學性質，較大的表面積，強大的生物相容性并具有突出的穩(wěn)定性。盡管納米材料本身可用作診斷和治療劑，但它們缺乏選擇性靶向能力。因此，適配體-納米材料復合物的設計與產生已應用在多個區(qū)域。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是通過特定的方法使核酸適配體能夠成功與PEG-PLGA納米粒結合在一起，使PEG-PLGA納米粒具有主動靶向性，同時提高核酸適配體在體內的生物活性。

本發(fā)明技術方案如下。

該發(fā)明中使用的物質是復乳法制備的PEG-PLGA納米粒(PLGA(50/50)分子量為17k,PEG的分子量為3.4k)表面具有羧基，而靶向CD30的核酸適配體通過已知序列合成后在3’端修飾氨基，由31個堿基組成，分子量為10315.09。

一種特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒的制備方法，先將納米粒上的羧基與交聯劑EDC/NHS反應后形成活化的羧基，再與核酸適配體上的氨基反應形成酰胺鍵，則能使核酸適配體成功鍵合在納米粒上。

上述方法中，采用的活化體系為EDC和NHS，所用的溶劑為pH＝5-6之間的MES，反應時間為8-14h。

上述方法中，所述納米粒與核酸適配體的反應摩爾比為1:1.2～1:1.5，而使用的交聯劑EDC與NHS之間的摩爾比2:1～1.5:1。

一種特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)取0.1g-0.4g的PEG-PLGA溶于4-5mL的二氯甲烷中，溶解后加入100-400μL的10mg/mL的DOX溶液，120W-160W超聲30s-1分鐘后，逐滴加入到15-25mL的0.5％-1.2％膽酸鈉溶液中，150W-250W冰浴下超聲5-7分鐘后，獲得粉紅色乳液，即載DOX的PEG-PLGA納米粒；

(2)將步驟(1)中的乳液加入到旋轉蒸發(fā)儀中，除去二氯甲烷，去離子水清洗3遍后，用pH＝5.5的MES重懸；