[發(fā)明專利]一種特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810986591.2
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN109125738A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏坤;羅逍;萬淑倩;牛雪明;莫燦龍
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: A61K47/69
• 分類號: A61K47/69;A61K47/54;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強(qiáng)

1.一種特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其特征在于，先將納米粒上的羧基與交聯(lián)劑EDC/NHS反應(yīng)后形成活化的羧基，再與核酸適配體上的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，則能使核酸適配體成功鍵合在納米粒上。

2.如權(quán)利要求1所述特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其特征在于，采用的活化體系為EDC和NHS，所用的溶劑為pH＝5-6之間的MES，反應(yīng)時間為8-14h。

3.如權(quán)利要求1所述特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其特征在于，所述納米粒與核酸適配體的反應(yīng)摩爾比為1:1.2～1:1.5，而使用的交聯(lián)劑EDC與NHS之間的摩爾比2:1～1.5:1。

4.權(quán)利要求1所述特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取0.1g-0.4g的PEG-PLGA溶于4-5mL的二氯甲烷中，溶解后加入100-400μL的10mg/mL的DOX溶液，120W-160W超聲30s-1分鐘后，逐滴加入到15-25mL的0.5％-1.2％膽酸鈉溶液中，150W-250W冰浴下超聲5-7分鐘后，獲得粉紅色乳液，即載DOX的PEG-PLGA納米粒；

(2)將步驟(1)中的乳液加入到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去二氯甲烷，去離子水清洗，用pH＝5.5的MES重懸；

(3)將步驟(2)中的溶液中加入350mM-450mM的EDC，常溫下磁力攪拌10-15分鐘，其中納米粒表面的羧基與EDC發(fā)生交聯(lián)，形成中間產(chǎn)物；

(4)在步驟(3)中加入200mM的Sulfo-NHS，NHS中羥基會與納米粒上的-COOH偶合形成一個O-異酰基脲結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為一種活化的中間產(chǎn)物，磁力攪拌下充分反應(yīng)30-60分鐘；

(5)加入10-20μL的β-巰基乙醇滅活未反應(yīng)的EDC與NHS，使用無酶水清洗納米粒；

(6)使用無酶水溶解合成的C2NP核酸適配體，配置成0.5-1mg/mL的適配體溶液，放入85-95℃的水浴中加熱10-15分鐘后，迅速取出，放置冰浴水中10-15分鐘迅速冷卻，致使核酸適配體變性，恢復(fù)其本身的特異型結(jié)構(gòu)；

(7)使用pH＝7.4的PBS緩沖液重懸步驟(5)中得到的產(chǎn)物，使反應(yīng)條件穩(wěn)定在pH＝7.4的環(huán)境下，加入1-2mL的步驟(6)所得的核酸適配體，攪拌反應(yīng)8-12h，其中核酸適配體上的氨基(-NH₂)基團(tuán)將會進(jìn)攻活化的中間產(chǎn)物部分，形成酰胺交聯(lián)，而活化的中間物將會被消除；

(8)反應(yīng)后使用超濾裝置過濾掉未反應(yīng)的核酸適配體，無酶水清洗后，重懸于無酶水，4℃下儲存?zhèn)溆茫玫教禺愋院怂徇m配體鍵合的PEG-PLGA納米粒。

5.由權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述方法制備得到特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒。

6.如權(quán)利要求5所述特異性核酸適配體鍵合的PEG-PLGA納米粒，其特征在于，靶向惡性淋巴瘤上的特征物質(zhì)CD30的核酸適配體C2NP的結(jié)構(gòu)為：

C2NP 5’-ACT GGG CGA AAC AAG TCT ATT GAC TAT GAG C-3’。