[發(fā)明專利]擴增子測序文庫的構建方法及引物組和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810986265.1
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN108998508B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設計）人: 雷湘華;江劍輝;黃爍丹;郭永超;王艷平;韓雙;黃萍;譚愛女
• 申請（專利權）人: 深圳聯(lián)合醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

發(fā)明屬于基因測序技術領域，具體涉及一種擴增子測序文庫的構建方法及引物組和試劑盒。該擴增子測序文庫的構建方法包括如下步驟：獲得樣本DNA；利用第一引物、第二引物和第三引物對所述樣本DNA進行第一PCR擴增，得到擴增產物；利用第四引物和第五引物對所述擴增產物進行第二PCR擴增，得到擴增子測序文庫。該擴增子測序文庫的構建方法可大大地節(jié)省試劑和工作量，降低成本，而且兩輪PCR的擴增效率都很高，最終構建的擴增子測序文庫具有更好的覆蓋度和均一性。

技術領域

本發(fā)明屬于基因測序技術領域，具體涉及一種擴增子測序文庫的構建方法及引物組和試劑盒。

背景技術

隨著近年來資訊通量的激增，高通量測序技術在生命科學及醫(yī)學領域方面的研究和應用越來越廣泛，特別是在疾病診斷及預防中發(fā)揮重要作用，其主要表現(xiàn)在產前篩查、腫瘤診斷、重大疾病預防、健康相關宏基因組分析等方面。雖然人類全基因組測序從測序時間和資金花費上已有了巨大的飛躍，但龐大的數(shù)據分析和遺傳信息提取將費時費力，相比較而言，全外顯子測序、基因Panel的測序將直擊可能引起疾病的大部分基因序列，而擴增子測序更強的目的性及快速的數(shù)據分析和少量資金花費等優(yōu)點將更有利于用于臨床疾病檢測，如作為新生兒篩查的二線檢測，采用illumina第二代高通量測序平臺對新生兒樣本進行某些先天代謝疾病基因深度測序，能靈敏地將那些攜帶先天疾病的新生兒在臨床癥狀尚未表現(xiàn)之前或表現(xiàn)輕微時檢測出來，通過篩查，得以早期診斷、早期治療，防止機體組織器官發(fā)生不可逆的損傷。

聚合酶鏈反應(即PCR)是一種廣泛運用于分子遺傳和診斷的技術，用于放大擴增特定的DNA片段，可看作是生物體外的特殊DNA復制。PCR的最大特點是將樣品中微量的DNA大幅增加，達到可檢測的水平。擴增子測序則是對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行測序，由于低廉的價格和簡便的操作，多重PCR是目標區(qū)段富集技術的重要手段。面對大量復雜基因組樣本的目標區(qū)段捕獲，多重PCR技術由于特異性強、價格低、重復性好等優(yōu)點，已成為首選技術。

目前，基于Illumina測序平臺的擴增子建庫主要采用傳統(tǒng)的兩步擴增建庫方法，即使用兩對引物進行兩輪PCR進行建庫。兩對引物的兩步擴增方法雖然可以直接使用Illumina相配套的試劑進行測序，但建庫過程中當樣本量較多時，而且，由于在第一輪擴增時沒有加入樣本標簽，使后續(xù)操作繁瑣且容易引起樣本間的交叉污染。即常用的兩輪PCR擴增子建庫方法一方面需對每個樣本單獨建庫，不能將大批量的樣本合并統(tǒng)一處理，操作繁瑣、建庫效率低，易引起樣本間的交叉污染；另一方面，在多重PCR反應中，隨著引物對數(shù)的增加，引物二聚體和非特異擴增產物會急劇增加，進而導致不同目標片段的拷貝數(shù)差異巨大，無法得到均一的產物；再次，采用的建庫引物合并了公用序列，使引物合成時不僅需要合成大量的特異性引物，還需合成等量的公用序列，耗費成本大，同時由于引物序列太長，降低了PCR擴增效率，文庫的覆蓋度及均一性受到影響。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種擴增子測序文庫的構建方法及引物組和試劑盒，旨在解決現(xiàn)有擴增子兩步建庫法的效率低、成本高，以及文庫的覆蓋度和均一性差的技術問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

本發(fā)明一方面提供一種擴增子測序文庫的構建方法，包括如下步驟：

獲得樣本DNA；

利用第一引物、第二引物和第三引物對所述樣本DNA進行第一PCR擴增，得到擴增產物；

利用第四引物和第五引物對所述擴增產物進行第二PCR擴增，得到擴增子測序文庫；

其中，

所述第一引物從5’端到3’端依次為第一測序標簽序列和擴增子特異性正向引物；

所述第二引物從5’端到3’端依次為第二測序標簽序列和擴增子特異性反向引物；