[發明專利]擴增子測序文庫的構建方法及引物組和試劑盒

有效

• 申請號: 201810986265.1
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN108998508B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 雷湘華;江劍輝;黃爍丹;郭永超;王艷平;韓雙;黃萍;譚愛女
• 申請（專利權）人: 深圳聯合醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

1.一種擴增子測序文庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

獲得多個樣本的DNA；

利用第一引物、第二引物和第三引物對每個所述樣本的DNA進行第一PCR擴增，得到每個所述樣本的擴增產物；在所述第一PCR擴增的步驟中，退火和延伸合并為一步，且每個循環中在58~62℃范圍內設置三個退火溫度；所述第一引物、所述第二引物和所述第三引物的摩爾比為3：1：3；

將所述多個樣本的PCR產物合并為一管，在同一管中，利用第四引物和第五引物對所述擴增產物進行第二PCR擴增，得到擴增子測序文庫；

其中，

所述第一引物從5’端到3’端依次為第一測序標簽序列和擴增子特異性正向引物；

所述第二引物從5’端到3’端依次為第二測序標簽序列和擴增子特異性反向引物；

所述第三引物從5’端到3’端依次為第二測序接頭序列、樣本標簽序列和所述第二測序標簽序列；所述樣本標簽序列用于標記不同的樣本；

所述第四引物從5’端到3’端依次為第一測序接頭序列和所述第一測序標簽序列；

所述第五引物為所述第二測序接頭序列。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，在所述第一PCR擴增的步驟之后，還包括第一磁珠純化的步驟；和/或

在所述第二PCR擴增的步驟之后，還包括第二磁珠純化的步驟。

3.如權利要求1-2任一項所述的構建方法，其特征在于，所述第一測序接頭序列如SEQID NO.1所示；和/或

所述第二測序接頭序列如SEQ ID NO.2所示；和/或

所述第一測序標簽序列如SEQ ID NO.3所示；和/或

所述第二測序標簽序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一種用于構建如權利要求1所述的擴增子測序文庫的引物組，其特征在于，所述引物組包括：用于第一PCR擴增的第一引物、第二引物和第三引物，以及用于第二PCR擴增的第四引物和第五引物，將所述第一PCR擴增后的PCR產物合并為一管，再進行所述第二PCR擴增；其中，

所述第一引物從5’端到3’端依次為第一測序標簽序列和擴增子特異性正向引物；

所述第二引物從5’端到3’端依次為第二測序標簽序列和擴增子特異性反向引物；

所述第三引物從5’端到3’端依次為第二測序接頭序列、樣本標簽序列和所述第二測序標簽序列，所述樣本標簽序列用于標記不同的樣本；

所述第四引物從5’端到3’端依次為第一測序接頭序列和所述第一測序標簽序列；

所述第五引物為所述第二測序接頭序列；

在所述第一PCR擴增的步驟中，退火和延伸合并為一步，且每個循環中在58~62℃范圍內設置三個退火溫度；所述第一引物、所述第二引物和所述第三引物的摩爾比為3：1：3。

5.如權利要求4所述的引物組，其特征在于，所述第一測序接頭序列如SEQ ID NO.1所示；和/或

所述第二測序接頭序列如SEQ ID NO.2所示；和/或

所述第一測序標簽序列如SEQ ID NO.3所示；和/或

所述第二測序標簽序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一種用于擴增子測序文庫構建的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求4-5任一項所述的引物組。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、DNA聚合酶。