[發明專利]一種檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組和雙重RT-PCR方法

有效

• 申請號: 201810985249.0
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN108913815B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 師志海;蘭亞莉;王文佳;王璟;施巧婷;徐照學
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州明華專利代理事務所(普通合伙) 41162
• 代理人: 王明朗

本發明公開了一種用于檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組，該引物組由用于檢測牛諾如病毒的引物和用于檢測牛冠狀病毒的引物組成，所述引物組的核苷酸序列如SEQ ID NO.1?SEQ ID NO.4所示。本發明還公開了一種檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的雙重RT?PCR方法，步驟如下：（1）合成上述用于檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組；（2）提取待測樣品中的RNA，以提取的RNA為模板反轉錄得到其cDNA；（3）以步驟（2）制得的cDNA為模板，采用步驟（1）合成的引物組進行PCR擴增反應；（4）分析PCR擴增產物。該雙重RT?PCR檢測方法簡便、快速、經濟、高效，可以大大節約檢測時間，提高檢測效率。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組和雙重RT-PCR方法。

背景技術

犢牛感染牛諾如病毒(Bovine Norovirus,BNoV)后，臨床上主要表現為腹瀉、厭食、脫水等癥狀，而且，牛諾如病毒常與牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)混合感染，給養牛業帶來巨大經濟損失。牛諾如病毒和牛冠狀病毒的感染均能引起3周齡以內的犢牛發病，且病毒引起的臨床癥狀和剖檢病變較為相似，僅靠初步的臨床癥狀和病理剖檢診斷疾病，極易造成誤診。因此，建立能夠同時檢測這兩種病原的診斷方法尤為必要。

傳統診斷牛諾如病毒與牛冠狀病毒的方法有電鏡檢查、病毒分離、抗原抗體ELISA檢測等，這些方法實驗周期長，對儀器設備要求高，經濟成本高，與臨床上大批量樣本所需的快速靈敏的檢測需求不匹配。RT-PCR技術是目前診斷此兩種疾病應用最廣泛的方法。相較于單重RT-PCR技術，多重RT-PCR能夠同時檢測多種病原，非常適合于臨床樣品的檢測，對于疾病的確診及流行病學調查起到重要作用。

2017年我國首次檢測出牛諾如病毒，牛諾如病毒在我國的流行病學調查及與其他病原共感染的情況目前國內尚無報道。因此，本實驗建立的牛諾如病毒和牛冠狀病毒的雙重RT-PCR檢測方法，能從糞便樣品中成功檢測出牛諾如病毒和牛冠狀病毒的RNA，特異性好，可應用于牛諾如病毒和牛冠狀病毒的流行病學調查，也為牛諾如病毒和牛冠狀病毒的早期快速診斷奠定基礎。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組和雙重RT-PCR方法。

為實現發明目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明首先提供了一種用于檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組，所述引物組由用于檢測牛諾如病毒的引物和用于檢測牛冠狀病毒的引物組成，其中，

所述用于檢測牛諾如病毒的引物的核苷酸序列為：

上游引物P1：5ˊ-GGCAAACCACGCAAACAAC-3ˊ(SEQ ID NO.1)，

下游引物P2：5ˊ-CTTCCGAAAGGGCACAGA-3ˊ(SEQ ID NO.2)；

所述用于檢測牛冠狀病毒的引物的核苷酸序列為：

上游引物P3：5ˊ-TAGTAGTTCAGAGGTGGAT-3ˊ(SEQ ID NO.3)，

下游引物P4：5ˊ-ACAAGTCTTCAGTAGGGT-3ˊ(SEQ ID NO.4)。

上述用于檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的引物組在制備檢測牛諾如病毒和/或牛冠狀病毒的試劑中的應用。

本發明還提供了一種用于檢測牛諾如病毒和牛冠狀病毒的試劑盒，所述試劑盒的成分組成包括PCR擴增試劑；所述PCR擴增試劑包括：Premix Taq、上游引物P1、下游引物P2、上游引物P3、下游引物P4、無菌雙蒸水。