[發(fā)明專利]一種重組載體CAR-CD244-antiPSMA的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810984124.6
• 申請(qǐng)日: 2017-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN109097401B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧雨春;尹樂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)健呈諾生物科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京衛(wèi)平智業(yè)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11392
• 代理人: 謝建玲;郝亮

1.一種重組載體CAR-CD244-antiPSMA的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、將特異性抗體編碼基因使用末端帶有BfuAI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

所述特異性抗體編碼基因序列為序列表序列3；

步驟2、將步驟1的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；

步驟3、將步驟2純化的PCR產(chǎn)物在BfuAI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行單酶切，并同時(shí)將含有改造的CD244骨架的克隆載體在BfuAI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行單酶切；

步驟4、將酶切后產(chǎn)物進(jìn)行純化；

步驟5、將純化后的產(chǎn)物按抗體片段與含有改造的CD244骨架的克隆載體摩爾比為3:1配比后，使用T4連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆提取質(zhì)粒測(cè)序；將在所述改造的CD244骨架的克隆位點(diǎn)區(qū)連入antiPSMA，得到的質(zhì)粒命名為：重組載體CAR-CD244-antiPSMA；

所述改造的CD244骨架序列如序列表序列1所示，其中，序列表序列1中的第1位至第63位所示序列為CD244上膜信號(hào)區(qū)的DNA序列；序列表序列1中的第64位至第95位所示序列為克隆位點(diǎn)區(qū)的DNA序列；序列表序列1中的第96位至第560位所示序列為CD244胞外鉸鏈區(qū)、CD244跨膜部分區(qū)與CD244胞內(nèi)部分區(qū)的DNA序列；序列表序列1中的第561位至第575位所示序列為DDDDK-tag標(biāo)記；序列表序列1中的第576位至第578位所示序列為終止密碼子。