[發明專利]一種重組載體CAR-CD244-antiPSMA的制備方法

有效

• 申請號: 201810984124.6
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN109097401B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 顧雨春;尹樂
• 申請（專利權）人: 國健呈諾生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙) 11392
• 代理人: 謝建玲;郝亮

本發明涉及一種重組載體CAR?CD244?antiPSMA的制備方法，包括以下步驟：步驟1、將特異性抗體編碼基因使用末端帶有BfuAI限制性內切酶識別位點的引物進行PCR擴增；所述特異性抗體編碼基因序列為PSMA抗體的部分序列，為序列表序列3；步驟2、將步驟1的PCR產物分別進行純化；步驟3、將步驟2純化的PCR產物在BfuAI限制性內切酶識別位點進行單酶切，并同時將含有改造的CD244骨架的克隆載體在BfuAI限制性內切酶識別位點進行單酶切；步驟4、將酶切后產物進行純化；步驟5、將純化后的產物按抗體片段與含有改造的CD244骨架的克隆載體摩爾比為3:1配比后，使用T4連接酶進行連接、轉化、涂板、挑取單克隆提取質粒測序；將連接正確的質粒，命名為：重組載體CAR?CD244?antiPSMA。

本申請是分案申請，原申請的申請號為201710209997.5，申請日為2017年3月31日，發明名稱為“一種CAR-NK細胞及其制備方法與應用”。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體說是一種重組載體CAR-CD244-antiPSMA的制備方法。

背景技術

細胞生物治療是運用自身免疫系統的新型癌癥治療方法，是一種具有顯著療效的治療模式。它運用分子生物學技術和細胞工程學技術，用生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞在體外進行培養和擴增，再回輸到病人體內，從而激發、增強機體自身的免疫功能，達到監視并殺滅病變細胞或修復受損細胞的目的。

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)屬于粒狀淋巴細胞，是機體重要的免疫細胞。二般認為NK細胞來源于骨髓淋巴樣干細胞，其分化、發育依賴于骨髓或胸腺微環境，主要分布于外周血和脾臟，在淋巴結和其他組織中也有少量存在。NK細胞不表達特異性抗原識別受體，是不同于T、B淋巴細胞的第三類淋巴細胞。與其他淋巴細胞相比，NK細胞的殺傷活性無MHC限制，無需抗原預先致敏，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒，而嗜天青顆粒的含量與NK細胞的殺傷活性呈正相關，故NK細胞作用于靶細胞后殺傷作用出現早，在體外1小時、體內4小時即可見到殺傷效應。NK細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞(包括部分細胞系)、病毒感染細胞等，因此NK細胞可直接殺傷某些腫瘤細胞和病毒感染細胞。這意味著NK細胞在機體抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節中會起到重要的作用。

CD244是由CD244基因編碼的人蛋白質，又稱為NK細胞受體2B4，是一個NK細胞重要的表面受體。NK細胞通過CD244受體激活細胞毒性功能。

CAR意為嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor)，當CAR結構與腫瘤相關抗原抗體融合表達在NK細胞的細胞膜表面時，能夠賦予NK細胞特異性識別對應腫瘤細胞的能力，此時的NK細胞即為CAR-NK細胞。一個完整的CAR結構通常包括上膜信號區、抗體區(通常來源于對應單克隆抗體的scFV段)、胞外校鏈區、跨膜區、胞內信號區。通過基因修飾過的NK細胞(CAR-NK)能夠對帶有其針對的抗原的細胞產生特異性更強的細胞殺傷作用，從而能夠達到對腫瘤等治療的效果。

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-l)來源的一種病毒載體，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果，是外源基因常用載體形式之一。其基本過程就是攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞或活體組織，實現外源基因在細胞或活體組織中表達。慢病毒載體在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、腫瘤細胞、干細胞、心肌細胞等多種類型的細胞。使用慢病毒載體能夠比較方便快捷地實現目的基因的長期、穩定表達。

目前，尚未建立一種有效的CAR-NK細胞制備的方法及其在腫瘤免疫治療方面的應用先例。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種CAR-NK細胞及其制備方法與應用。