[發明專利]基于數字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的引物及其試劑盒與方法

在審

• 申請號: 201810979743.6
• 申請日: 2018-08-24
• 公開（公告）號: CN108977558A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 李麗麗;孟赫誠;溫雯;石磊;劉雨琦
• 申請（專利權）人: 暨南大學;華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

本發明公開了一種基于數字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的引物及其試劑盒與方法。試劑盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物組合、無RNA酶的超純水、細菌總DNA提取試劑、陰性對照和陽性對照。其檢測方法是通過提取待檢樣品DNA，配置LAMP反應體系，進行微滴化和LAMP反應后，通過檢測熒光信號，判斷待檢樣品是否含有金黃色葡萄球菌，并測定其含量。本發明具有快速、精準、靈敏、適用性廣，無需依賴變溫擴增設備，可實現絕對定量等優點，為食品中的金黃色葡萄球菌的快速準確檢測提供有效分析手段。

技術領域

本發明涉及一種金黃色葡萄球菌測試裝備，具體涉及一種基于數字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人類的一種重要病原菌，廣泛存在于自然界中，易污染肉類和乳制品等食品。我國每年都有由于金黃色葡萄球菌污染而引起的食物中毒事件，因而我國對在乳制品、肉制品等中的金黃色葡萄球菌都規定有嚴格的限量要求。因此需要建立肉類和乳制品等食品中金黃色葡萄球菌的快速、靈敏和特異的檢測方法。

目前，實驗室常用的檢測金黃色葡萄球菌的方法有傳統方法(細菌分離)、免疫學方法(免疫磁性微球技術、免疫熒光技術和酶聯免疫吸附試驗等)和分子生物學檢測技術(常規PCR，實時熒光定量PCR和環介導等溫擴增技術等)。傳統的細菌分離和免疫學方法檢測方法，存在耗時長、對檢測人員技術要求高、操作復雜以及敏感性差等諸多不足。分子生物學檢測技術，如PCR操作復雜，需進行跑膠分析，并且靈敏度低；實時熒光PCR需使用昂貴的儀器設備并依賴標準曲線進行定量檢測，靈敏度仍存在一定的局限性；環介導等溫擴增技術由于引物間的非特異性擴增而易產生假陽性結果。

數字環介導等溫擴增技術(digital loop-mediated isothermalamplification,dLAMP)是基于第三代數字PCR技術原理，將預混的LAMP體系進行微滴化處理，形成幾萬至幾十萬個油包水的液化微滴中，保證每個微滴中含有一個或不含有核酸模板，經過LAMP擴增后，經過熒光檢測每個微滴中的陽性微滴數和陰性微滴數，根據泊松分布原理即可計算出核酸模板的初始拷貝數。該方法具有以下優點：①特異性強：針對靶基因的不同區域設計多對特異引物，不會受到反應混合物中存在的其他非靶序列的影響，同時可根據熔解曲線鑒別非特異性擴增；②靈敏性高:dLAMP檢測的是熒光信號，能檢測到普通PCR的1/10-1/100的拷貝數；③恒溫：該技術反應體系只需在恒定溫度下就能擴增反應，不需要預先進行雙鏈的變性；④快速：LAMP反應在15-60min即可完成；⑤設備簡單：不需要特殊的變溫設備。

為了解決上述傳統方法檢測金黃色葡萄球面臨的問題，迫切需要開發一種快速、高效、低成本的檢測技術，并實現檢測試劑商品化，這將對乳制品、肉制品等中金黃色葡萄球菌污染的防控帶來極大便利。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種數字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，能夠應用于金黃色葡萄球菌的快速、精準檢測。

本發明的第一個技術目的是提供用于檢測金黃色葡萄球菌的特異性引物，其核苷酸序列分別：

外引物F3：TCGCAGTATTGGTATTATTCTTGA(SEQ ID NO：1)；

外引物B3：GTAAGTTCACTGTGACTCGTAA(SEQ ID NO：2)；

內引物FIP：AAGACATTGTCTGCATTATCAGCAAGCTGATGATATACCA

CGCAT(SEQ ID NO：3)；

內引物BIP：AGCCTATGGAAATTGCCCTCGAAGTAACAGCCTATGTCAT

TCAT(SEQ ID NO：4)；