[發(fā)明專利]基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的引物及其試劑盒與方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810979743.6
• 申請日: 2018-08-24
• 公開（公告）號: CN108977558A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 李麗麗;孟赫誠;溫雯;石磊;劉雨琦
• 申請（專利權）人: 暨南大學;華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

1.一種基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的引物，包括內(nèi)引物FIP和BIP，外引物F3和B3，環(huán)引物LF和LB，其核苷酸序列分別如下所示：

外引物F3：TCGCAGTATTGGTATTATTCTTGA

外引物B3：GTAAGTTCACTGTGACTCGTAA

內(nèi)引物FIP：AAGACATTGTCTGCATTATCAGCAAGCTGATGATATACCACGCAT

內(nèi)引物BIP：AGCCTATGGAAATTGCCCTCGAAGTAACAGCCTATGTCATTCAT

環(huán)引物LF：AACCACGACCTTCACCTT

環(huán)引物LB：CTGACAATCCTTATGAGGTGCT。

2.如權利要求1所述的基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的引物，其特征在于：擴增反應時，內(nèi)引物FIP和BIP，環(huán)引物LF和LB和外引物F3和B3的摩爾比為8：4：1。

3.一種基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于，試劑盒包含權利要求1或2中所述的引物。

4.如權利要求3所述的基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于，還包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddLAMP Supermix；(2)無RNA酶的超純水；(3)陽性對照和陰性對照；(4)細菌總DNA提取試劑。

5.如權利要求4所述的基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于：所述2×ddLAMP Supermix包含以下試劑：內(nèi)引物FIP和BIP各160μmol/L，外引物F3和B3各80μmol/L，環(huán)引物LF和LB各160μmol/L，1×TE，50mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，250mmol/L KCl，200mmol/L MgSO₄，250mmol/L(NH4)₂SO₄，2.8％Tween-20，7.14mol/L甜菜堿，10mmol/LdNTP，Bst大片斷DNA聚合酶160U，20×EvaGreen，RNase Cocktail。

6.如權利要求4所述的基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于：陽性對照為豬金黃色葡萄球菌DNA，陰性對照為去離子水。

7.一種基于數(shù)字LAMP技術檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)細菌DNA的提取

1)取待檢樣品1g，加入600μL裂解液A研磨后，渦旋混勻20s，室溫靜置10min；

2)將混合液移至吸附柱中，12,000×g離心30～60s；

3)丟棄收集管中液體，加入500μL洗液B至吸附柱中，12,000×g離心30～60s；

4)丟棄收集管中液體，加入500μL洗液C至吸附柱中，12,000×g離心30～60s；

5)丟棄收集管中液體，12,000×g離心2min以甩干柱子；

6)將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向柱子中央加入洗脫液50μL，室溫靜置2min，12,000×g離心1min，離心管中液體即為模板DNA；

(2)數(shù)字LAMP操作

1)待檢樣品、陰性對照和陽性對照每個反應管各加入數(shù)字LAMP反應液19μL；分別取1μL模板DNA，加入相應的反應管中，配置成20μL數(shù)字LAMP反應體系；所述模板DNA包括待檢樣品、陰性對照和陽性對照；

2)將20μL樣品反應液加入到微滴發(fā)生卡內(nèi)，制備微滴；

3)將微滴轉(zhuǎn)入PCR板中，放入PCR儀中進行擴增；

4)將擴增完成的PCR板放入微滴分析儀中，檢測微滴中的熒光信號，分析數(shù)據(jù)，顯示檢測結果；

5)結果判定及描述：陽性對照：20±2個拷貝，陰性對照：＜1個拷貝時，實驗結果成立；待檢測樣品結果≥1個拷貝時為陽性；待檢測樣品結果＜1個拷貝時為陰性。