[發明專利]一種基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法

在審

• 申請號: 201810978721.8
• 申請日: 2018-08-27
• 公開（公告）號: CN108864179A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 孫娜;陳晉;林松毅;鮑志杰;李冬梅;沈佳穎
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: C07F9/10
• 分類號: C07F9/10
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

1.一種基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、填料活化：取200～300目的混合硅膠粉加熱活化；

S2、裝柱：向步驟S1活化后的硅膠粉中加入氯仿，攪拌成漿狀，濕法裝入玻璃層析柱中，制得硅膠柱；

S3、上樣：取蛋黃粗磷脂，用氯仿充分溶解得樣品溶液，將所述的樣品溶液沿柱壁加入步驟S2制備的硅膠柱中；

S4、梯度洗脫：當步驟S3中所述的樣品溶液流至硅膠面時，用10～20倍柱體積、體積比為18:5:1～17:5:1的氯仿、甲醇、冰醋酸三元混合溶液進行第一次洗脫；之后用30～50倍柱體積、積比為16:5:1～10:5:1的氯仿、甲醇、冰醋酸體三元混合液進行第二次洗脫，收集第二次洗脫的洗脫液。

S5、薄層色譜檢測：對步驟S4收集到的洗脫液用薄層色譜進行檢測，測定洗脫液中組分是否為目標組分，所述目標組分為：薄層色譜檢測中出現單一斑點，且與磷脂酰膽堿標準品有同一遷移率的組分；

S6、樣品濃縮：把步驟S5所述含有目標組分的洗脫液收集在一起，濃縮成膏狀，干燥，得到蛋黃磷脂酰膽堿，所述蛋黃磷脂酰膽堿純度為90～98％。

2.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，步驟S1所述加熱活化為：50～60℃，4～6h。

3.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，步驟S2所述的玻璃層析柱的直徑和柱長比為(2～5):25。

4.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，步驟S3所述蛋黃粗磷脂，添加量為10～20mg/g硅膠粉。

5.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，步驟S3所述蛋黃粗磷脂與氯仿的料液比為150～300:1mg/mL。

6.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，步驟S3所述蛋黃粗磷脂中，磷脂酰膽堿的含量大于60％，磷脂酰乙醇胺的含量大于16％。

7.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，步驟S5所述的薄層色譜檢測具體為，每收集0.25倍柱體積洗脫液用薄層色譜檢測一次，用體積比為75:40:8:3的氯仿、甲醇、冰醋酸和水的混合液作為展開劑進行展開。

8.根據權利要求1所述基于低壓柱層析的蛋黃磷脂酰膽堿制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、填料活化：稱取15g、目數為200～300的混合硅膠粉，在50℃的烘箱里活化6h；

S2、裝柱：選擇長為200mm，直徑為16mm的玻璃層析柱對磷脂酰膽堿進行分離純化，向步驟S1活化后的硅膠粉中加入30mL氯仿攪拌成漿狀，采用濕法裝柱法將硅膠裝入到玻璃層析柱中，得硅膠柱；

S3、將200mg的蛋黃粗磷脂用1mL氯仿溶解后沿柱壁加入步驟S2制備的硅膠層析柱內；

S4、梯度洗脫：先用20倍柱體積、體積比為18:5:1的氯仿、甲醇、冰醋酸三元混合溶液進行第一次洗脫；再用50倍柱體積、體積比為16:5:1的氯仿、甲醇、冰醋酸三元混合溶液為進行第二次洗脫，收集第二次洗脫的洗脫液；

S5、薄層色譜檢測：將步驟S4收集的洗脫液用薄層色譜鑒定樣品組成，每收集10mL鑒定一次，進行薄層色譜展開時，展開劑為體積比為75:40:8:3的氯仿、甲醇、冰醋酸和水的混合液，層析完畢后，取出薄板，干燥，放入碘缸內蓋好，5min后有黃色斑點產生；如果薄層色譜檢測中出現單一斑點，且與標準品磷脂酰膽堿具有同一遷移率，則判斷所檢測洗脫液中含有磷脂酰膽堿組分；

S6、樣品濃縮：收集步驟S5鑒定為含有磷脂酰膽堿組分的洗脫液，旋轉蒸發濃縮成膏狀之后用氮吹儀進行干燥，得蛋黃磷脂酰膽堿；高效液相色譜鑒定本實施例制得的蛋黃磷脂酰膽堿純度為98％。