[發(fā)明專利]一種以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜介質(zhì)及其制備方法與應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-08-27
• 公開（公告）號: CN109107536B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王驪麗;王志穎;李維敏;任怡;王思堯;張念喆
• 申請（專利權(quán)）人: 西北大學
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22;B01J20/281;B01J20/286;B01J20/30;C07K1/22;C07K14/77;C07K14/80
• 代理公司: 西安億諾專利代理有限公司 61220
• 代理人: 韓素蘭

本發(fā)明公開一種以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜介質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式為：；本發(fā)明還公開所述高效疏水相互作用色譜介質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：（1）硅膠活化；（2）制備環(huán)氧化硅膠；（3）環(huán)氧開環(huán)制備高效疏水相互作用色譜介質(zhì)；同時，本發(fā)明還公開將所述高效疏水相互作用色譜介質(zhì)應(yīng)用于高效液相色譜中來分離制備天然蛋白卵清蛋白和細胞色素C的應(yīng)用，回收簡單，收回率高，制備的卵清蛋白、細胞色素C純度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于液相色譜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜介質(zhì)及其制備方法，和其用于分離天然蛋白的應(yīng)用。

背景技術(shù)

天然蛋白是在自然界中存在的，不經(jīng)過人工任何修飾或加工直接從天然材料中可以獲得的一類蛋白。其生物安全性高，廣泛地用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。例如，卵清蛋白是一種天然糖蛋白，含有386個氨基酸，相對分子質(zhì)量為45KDa，其等電點為4.5。卵清蛋白無論從分子結(jié)構(gòu)還是生物學功能上都與人血白蛋白非常類似，是人血白蛋白的潛在替代品。具有廣泛的應(yīng)用，可以經(jīng)過酶水解加工成低分子活性肽具有強抗氧化活性、血管舒張活性等活性；與三價鐵離子結(jié)合可作為天然載體用于開發(fā)成復(fù)合補鐵劑。

此外，細胞色素C（Cyt-c）也是從天然材料中提取的一種天然蛋白，臨床上用于各種組織缺氧急救的輔助治療，如一氧化碳中毒、催眠藥中毒、氰化物中毒、新生兒窒息、嚴重休克期缺氧、腦血管意外、腦震蕩后遺癥、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困難和各種心臟疾患引起的心肌缺氧的治療。與卵清白蛋白不同，分子量較小約為13 KDa，等電點10.6左右。肽鏈中含有19個賴氨酸殘基。雞蛋清和各類動物心臟分別富含卵清蛋白和細胞色素CC，所以其來源很方便。

目前，卵清蛋白和細胞色素C的分離主要采用多步鹽析沉淀分離-離子交換色譜純化的方法。例如，將雞蛋清和豬心處理的樣品用不同的鹽（硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等）粗分離，然后再結(jié)合離子交換層析法純化。這類方法的缺點是前者產(chǎn)品含鹽量高，需要多次脫鹽和離心等操作才能獲得較高純度的卵清白蛋白，而后者增加了純化的步驟。有報道利用硫酸溶液提取、沸石捕集、硫酸銨分級、三氯乙酸沉淀以及離子交換色譜純化等五大步驟提取細胞色素C，不僅整個過程繁瑣，而且提取條件較劇烈，耗時長，收率也不高。

近年來，通過化學改性，使用具有兩種以上的官能團的配基分子合成MMC（混合模式色譜）固定相，并將其用于蛋白質(zhì)分離的研究越來越受到了關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜（HPHIC）介質(zhì)及其制備方法，同時提供將所述介質(zhì)用于天然蛋白分離的應(yīng)用，分離工藝簡單，分離回收率高，分離回收得到的蛋白質(zhì)純度高。

一種以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜介質(zhì)，所述高效疏水相互作用色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下：

。

上述以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜介質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：

（1）硅膠活化；

（2）制備環(huán)氧化硅膠：按照1g：50mL將步驟（1）得到的活化硅膠加入無水甲苯中，超聲處理3-5min，然后在攪拌條件下向其中緩慢加入硅烷偶聯(lián)劑，所述活化硅膠和硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量體積比為1g:1mL~1g:2 mL，升溫至90-120 ℃，回流并攪拌9-12h，然后用甲醇、水、甲醇洗滌抽濾，重復(fù)洗滌抽濾5次，真空干燥，即得到環(huán)氧硅膠；

（3）環(huán)氧開環(huán)制備高效疏水相互作用色譜介質(zhì)：按照體積比1:200，將芐胺加入干燥的1，4-二氧六環(huán)溶液中，超聲處理3-5min，向其中加入環(huán)氧硅膠，所述環(huán)氧化硅膠和卞胺的質(zhì)量比為1:2~1:4，超聲處理，然后在80 ℃下回流并攪拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗滌抽濾，重復(fù)洗滌抽濾5次，真空干燥，即可。