[發明專利]一種以卞胺為配基的高效疏水相互作用色譜介質及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201810978259.1
• 申請日: 2018-08-27
• 公開（公告）號: CN109107536B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 王驪麗;王志穎;李維敏;任怡;王思堯;張念喆
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22;B01J20/281;B01J20/286;B01J20/30;C07K1/22;C07K14/77;C07K14/80
• 代理公司: 西安億諾專利代理有限公司 61220
• 代理人: 韓素蘭

1.一種高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：所述應用為將所述高效疏水相互作用色譜介質應用于高效液相色譜中來分離制備天然蛋白；

所述分離制備天然蛋白具體如下：

（1）將含有天然蛋白的樣品進行預處理；

（2）將所述高效疏水相互作用色譜介質裝填在高效液相色譜儀的色譜柱中，將步驟（1）處理得到的樣品直接進樣100μL，進入色譜柱，用流動相A沖洗色譜柱至基線平穩，然后采用流動相B線性從0-100%線性梯度洗脫20-30min，在達到100%時延長洗脫5-10min，流動相A和流動相B的流速均為1.0-2.0 mL/min，檢測波長為280nm，收集色譜餾分，經過SDS-15%PAGE分析，即得到天然蛋白；

所述流動相A為2.0~3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄和10.0 ~50.0 mmol/L KH₂PO₄的混合液，且pH為7.5；所述流動相B為10.0 ~50.0 mmol/L KH₂PO₄，且pH為7.5；

其中，所述高效疏水相互作用色譜介質的結構式如下：

；

所述高效疏水相互作用色譜介質是通過以下方法制備得到的：

（1）硅膠活化；

（2）制備環氧化硅膠：按照1g：50mL將步驟（1）得到的活化硅膠加入無水甲苯中，超聲處理3-5min，然后在攪拌條件下向其中緩慢加入硅烷偶聯劑，所述活化硅膠和硅烷偶聯劑的質量體積比為1g:1mL~1g:2 mL，升溫至90-120 ℃，回流并攪拌9-12h，然后用甲醇、水、甲醇洗滌抽濾，重復洗滌抽濾5次，真空干燥，即得到環氧化 硅膠；

（3）環氧開環制備高效疏水相互作用色譜介質：按照體積比1:200，將芐胺加入干燥的1，4-二氧六環溶液中，超聲處理3-5min，向其中加入環氧化 硅膠，所述環氧化硅膠和卞胺的質量比為1:2~1:4，超聲處理3-5min，然后在80 ℃下回流并攪拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗滌抽濾，重復洗滌抽濾5次，真空干燥，即可。

2.根據權利要求1所述高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：步驟（1）所述硅膠活化的步驟具體如下：按照質量體積比1g:10mL ~1g:20mL將未活化的硅膠加入質量濃度為20%的鹽酸溶液中，在120℃下回流并攪拌2-6h，用蒸餾水洗滌抽濾至中性，在100~150℃真空干燥箱中干燥12~24h，即得到活化硅膠。

3.根據權利要求2所述高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：所述未活化的硅膠孔徑為80~200 、粒徑為5~10μm的球狀硅膠。

4.根據權利要求1所述高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：步驟（2）所述硅烷偶聯劑為γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。

5.根據權利要求1所述高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：步驟（2）和步驟（3）中真空干燥的條件均為：在60℃下真空干燥12h。

6.根據權利要求1所述高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：所述樣品為雞蛋清，分離制備的天然蛋白為卵清蛋白，步驟（1）將含有天然蛋白的樣品進行預處理具體如下：在雞蛋清中加入5倍體積的20.0 mmol/L、pH=6.5的KH₂PO₄緩沖溶液，攪拌均勻，在4℃、8000rpm的條件下離心處理20 min，將離心得到的上清液用0.45μm濾膜過濾后，所得濾液為預處理得到的樣品，保存在4℃下，備用。

7.根據權利要求1所述高效疏水相互作用色譜介質的應用，其特征在于：所述樣品為豬心，分離制備的天然蛋白為細胞色素C，步驟（1）將含有天然蛋白的樣品進行預處理具體如下：將豬心清洗，去除表皮的脂肪和肌腱后，在絞肉機中絞碎至直徑小于1cm的顆粒，按照1g：1mL加水稀釋，調節pH為4.0，然后攪拌2 h，再調節pH為7.0，過濾，將濾液在4℃下靜置12h，然后在4 ℃、8000 rpm條件下離心20 min，留取上清液，將上清液用0.45 μm的濾膜過濾得到的濾液即為預處理得到的樣品，保存在4℃下，備用。