[發(fā)明專利]體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810971897.0
• 申請日: 2018-08-24
• 公開（公告）號: CN110857436B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳舒怡;王靜
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/01
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 向薇;萬志香

本發(fā)明提供一種體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞的方法，所述的方法包括：獲取染色體上整合有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的體細胞；誘導培養(yǎng)，獲得視網(wǎng)膜節(jié)細胞；所述誘導培養(yǎng)包括：先將所述體細胞接種于添加有強力霉素的MEF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～3天；再更換為添加有強力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)11～13天；并且，在所述誘導培養(yǎng)開始的第1至5天，所述培養(yǎng)基中添加FGF2。本發(fā)明在重編程過程中選擇細胞生長因子FGF2添加至誘導培養(yǎng)基，特別是配合選擇合適的時機加入，重編程效率可達30％以上。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，特別是涉及一種體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞的方法。

背景技術

自諾貝爾獎得主山中伸彌發(fā)現(xiàn)通過過表達Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子可以將體細胞重編程為多能干細胞(iPS)以來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)通過過表達組織特異性轉(zhuǎn)錄因子可以將體細胞直接重編程為其它譜系的體細胞，而無需經(jīng)過多能干細胞階段(體細胞直接重編程)。2010年，美國的Marius Wernig實驗室發(fā)現(xiàn)同時過表達Ascl1，Brn2和Myt1l，可以將小鼠成纖維細胞高效地直接重編程為Tuj1陽性的神經(jīng)元(Nature 2010，463：1035-41)。這一發(fā)現(xiàn)為再生治療神經(jīng)退行性疾病開辟了嶄新，方便而快捷的供體細胞制備途徑。但是這一方法得到的神經(jīng)元僅僅是普通的泛神經(jīng)元，而治療各種神經(jīng)退行性疾病需要針對此疾病的特定神經(jīng)元亞型。為此，人們通過篩查不同的因子組合實現(xiàn)了體細胞直接重編程制備多巴胺神經(jīng)元，運動神經(jīng)元等神經(jīng)元亞型的有效方法。但是當前尚缺乏體細胞直接重編程制備視網(wǎng)膜神經(jīng)元的有效方法。

在發(fā)病率最廣泛的視網(wǎng)膜退行性疾病-青光眼中視網(wǎng)膜節(jié)細胞受到損害而永久丟失，導致視力不可逆喪失。視網(wǎng)膜節(jié)細胞移植治療有望解決青光眼不治之難題。因此建立體細胞直接重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞的方法具有巨大的臨床應用價值，但當前在此領域進展有限。雖然有報道，過表達Ascl1，Brn3b和Ngn2可以將小鼠成纖維細胞重編程為Brn3a陽性的視網(wǎng)膜節(jié)細胞樣細胞(Neuroscience 2013,250:381-93)，但是此報道中的方法獲得視網(wǎng)膜節(jié)細胞樣神經(jīng)元的效率不夠高。

申請?zhí)枮?018104904910的在先申請，通過將外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到體細胞，重編程直接獲得視網(wǎng)膜節(jié)細胞，但是重編程效率較低，僅能達到10％。

因此，亟待探索一種效率高的體細胞直接重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的主要目的是提供一種提高體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞效率的方法。

本發(fā)明的主要目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細胞的方法，所述的方法包括：

(1)獲取染色體上整合有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的體細胞；

(2)誘導培養(yǎng)，獲得視網(wǎng)膜節(jié)細胞；

所述誘導培養(yǎng)包括：

先將所述體細胞接種于添加有FGF2、強力霉素的MEF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～3天；

再更換為添加有FGF2、強力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第5天；

然后更換為添加強力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8天。

在其中一個實施例中，所述的培養(yǎng)基中添加有5～40ng/ml的FGF2。

在其中一個實施例中，所述的培養(yǎng)基中添加有10～40ng/ml的FGF2。

在其中一個實施例中，所述誘導培養(yǎng)包括：