[發(fā)明專利]體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810971897.0
• 申請(qǐng)日: 2018-08-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110857436B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳舒怡;王靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)中山眼科中心
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867;C12N7/01
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 向薇;萬(wàn)志香

1.一種體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)獲取染色體上整合有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的體細(xì)胞；

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞；

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)包括：

先將所述體細(xì)胞接種于添加有FGF2、強(qiáng)力霉素的MEF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～3天；

再更換為添加有FGF2、強(qiáng)力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第5天；

然后更換為添加強(qiáng)力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8天；

所述的培養(yǎng)基中添加5～40ng/ml的FGF2；

所述強(qiáng)力霉素的濃度為1～3μg/ml；

所述神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基為Neurobasal培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述DMEM/F12與神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的體積比為1:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基中添加10～40ng/ml的FGF2。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)包括：

先將所述體細(xì)胞接種于添加有FGF2、強(qiáng)力霉素的MEF培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天；

再更換為添加有FGF2、強(qiáng)力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第5天；

然后更換為添加強(qiáng)力霉素的DMEM/F12與神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，獲取染色體上整合有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的體細(xì)胞，包括如下步驟：

獲取體細(xì)胞；

構(gòu)建慢病毒顆粒，用所述慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染所述體細(xì)胞，從而將Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到體細(xì)胞染色體上。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述慢病毒顆粒的構(gòu)建包括如下步驟：

1)獲取Ascl1基因的全長(zhǎng)cDNA、Islet1基因的全長(zhǎng)cDNA、Brn3b基因的全長(zhǎng)cDNA；

2)將所述Ascl1基因的全長(zhǎng)cDNA、Islet1基因的全長(zhǎng)cDNA、Brn3b基因的全長(zhǎng)cDNA克隆到同一慢病毒載體上，獲得慢病毒表達(dá)質(zhì)粒；

3)用慢病毒表達(dá)質(zhì)粒、誘導(dǎo)因子表達(dá)質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，然后于包裝細(xì)胞的上清液中收集慢病毒顆粒。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，獲取所述Brn3b基因的全長(zhǎng)cDNA的步驟包括：

提取小鼠胚胎頭部組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA庫(kù)；以所述cDNA庫(kù)為模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或/和，

獲取Islet1基因的全長(zhǎng)cDNA的步驟包括：

提取小鼠胚胎頭部組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA庫(kù)；以所述cDNA庫(kù)為模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或/和，

獲取所述Ascl1基因的全長(zhǎng)cDNA的步驟包括：

以TetO-FUW-Ascl1為模板，以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述Brn3b基因的全長(zhǎng)cDNA如SEQ ID No.9所示；所述Islet1基因的全長(zhǎng)cDNA如SEQ ID No.8所示；所述Ascl1基因的全長(zhǎng)cDNA如SEQ ID No.7所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的體外重編程制備視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的慢病毒載體為pSicoR-TetO；所述誘導(dǎo)因子表達(dá)質(zhì)粒為誘導(dǎo)因子rtTA表達(dá)質(zhì)粒；所述包裝細(xì)胞為HEK293細(xì)胞；所述包裝質(zhì)粒為psPAX2、pMD2.G。