[發明專利]一種L-酪氨酸基因工程菌及其生產L-酪氨酸的方法

在審

• 申請號: 201810963798.8
• 申請日: 2018-08-23
• 公開（公告）號: CN109266592A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 徐慶陽;蔡萌萌;陳寧;張成林;李燕軍;范曉光;謝希賢;馬倩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明公開一種L?酪氨酸基因工程菌及其生產L?酪氨酸的方法，所述基因工程菌敲除了L?苯丙氨酸合成酶基因pheA及其調控基因pheL，將木糖啟動子PxylF控制的T7噬菌體RNA聚合酶整合到lacZ位點，將由T7啟動子控制的tyrA(M53I,A354V)?tyrB整合到tyrR位點，T7啟動子控制的aroG(S180F)整合到yghX假基因位點。利用該菌株進行搖瓶發酵24h可積累L?酪氨酸6.8g/L，在5L發酵罐中發酵30h產量可達37.8g/L。所述基因工程菌不攜帶質粒，發酵過程中不需要添加抗生素，同時使用木糖誘導關鍵酶基因的高效表達，降低了生產成本，避免了IPTG等誘導劑對細胞的傷害，所述生產L?酪氨酸的方法簡單、可控性強，適合于工業化大規模生產。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種L-酪氨酸基因工程菌及其生產L-酪氨酸的方法。

背景技術

L-酪氨酸(L-β-對羥苯基-β-丙氨酸；(2S,3R)-2-氨基-3-對羥苯基丙酸)屬于芳香族氨基酸，是人體的條件必需氨基酸，它常作為營養補充劑及L-多巴、對羥基肉桂酸、對羥基苯乙烯等醫藥化工產品的制備原料被廣泛用于食品、飼料、醫藥和化工等行業。L-酪氨酸的生產方法包括蛋白水解法、化學合成法、酶法和直接發酵法。傳統的L-酪氨酸生產方法主要是蛋白水解法和酶法，但這些方法存在諸多缺點，如原料來源有限、反應過程中酶活性和穩定性差、工藝繁瑣、產品成分復雜等。而微生物直接發酵法生產氨基酸具有原料來源廣泛、反應溫和、操作簡單等優勢。隨著代謝工程技術的不斷發展，對微生物中L-酪氨酸的合成途徑進行合理設計和優化以實現L-酪氨酸的發酵生產成為研究熱點。

目前，L-酪氨酸的合成途徑和調控機制以大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中研究的最為清晰，其代謝途徑改造主要集中在解除途徑調控、增加前體供應、阻斷競爭途徑和調節轉運系統等幾個方面。雖然已報道的關于L-酪氨酸代謝工程的研究已經充分闡釋了其代謝途徑中的關鍵基因、調控機理和改造靶點等，但L-酪氨酸的發酵生產依然存在產量低或糖酸轉化率低的問題，且目前還沒有成熟的發酵法生產技術來進行L-酪氨酸的工業化生產。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種L-酪氨酸基因工程菌。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供一種利用上述基因工程菌生產L-酪氨酸的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案之一是：

一種L-酪氨酸基因工程菌，所述基因工程菌是通過代謝工程的方法對大腸桿菌中L-酪氨酸合成相關基因進行對應改造，阻斷競爭途徑苯丙氨酸合成途徑，解除關鍵酶的反饋抑制和轉錄負調控，并利用木糖啟動子誘導來源于T7噬菌體的RNA聚合酶，結合T7強啟動子系統啟動關鍵酶基因的高效表達。

所述基因工程菌敲除了L-苯丙氨酸合成酶基因pheA及其調控基因pheL，將木糖啟動子PxylF控制的T7噬菌體RNA聚合酶整合到lacZ位點，將由T7啟動子控制的tyrA(M53I,A354V)-tyrB整合到tyrR位點，T7啟動子控制的aroG(S180F)整合到yghX假基因位點。

本發明的技術方案之二是：上述基因工程菌的構建方法，具體步驟如下：

(1)采用大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯技術，以E.coli W3110為出發菌株，敲除pheLA基因；

(2)構建木糖啟動子PxylF和T7RNA聚合酶T7RNAP的連接片段，并將其整合至lacZ位點；

(3)構建PT7啟動子和tyrA(M53I,A354V)-tyrB的連接片段，并將其整合至tyrR位點。

(4)構建PT7啟動子和aroG(S180F)的連接片段，并將其整合至yghX假基因位點；

本發明的技術方案之三是：利用上述基因工程菌生產L-酪氨酸的方法。