[發明專利]一種L-酪氨酸基因工程菌及其生產L-酪氨酸的方法在審
| 申請號： | 201810963798.8 | 申請日： | 2018-08-23 |
| 公開（公告）號： | CN109266592A | 公開（公告）日： | 2019-01-25 |
| 發明（設計）人： | 徐慶陽;蔡萌萌;陳寧;張成林;李燕軍;范曉光;謝希賢;馬倩 | 申請（專利權）人： | 天津科技大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12P13/08;C12R1/19 |
| 代理公司： | 天津盛理知識產權代理有限公司 12209 | 代理人： | 趙瑤瑤 |
| 地址： | 300457 天津市濱*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基因工程菌 酪氨酸 整合 位點 發酵 合成酶 關鍵酶基因 木糖啟動子 苯丙氨酸 調控基因 發酵過程 高效表達 基因位點 木糖誘導 搖瓶發酵 可控性 誘導劑 菌株 質粒 抗生素 生產 生產成本 細胞 攜帶 基因 傷害 積累 | ||
1.一種L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌敲除了L-苯丙氨酸合成酶基因pheA及其調控基因pheL，將木糖啟動子PxylF控制的T7噬菌體RNA聚合酶整合到lacZ位點，將由T7啟動子控制的tyrA(M53I,A354V)-tyrB整合到tyrR位點，T7啟動子控制的aroG(S180F)整合到yghX假基因位點。
2.如權利要求1所述的一種L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以E.coli W3110為出發菌株。
3.構建權利要求1所述的L-酪氨酸基因工程菌的方法，其特征在于：構建步驟如下：
(1)采用大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯技術，以E.coli W3110為出發菌株，敲除pheLA基因；
(2)構建木糖啟動子PxylF和T7RNA聚合酶T7RNAP的連接片段，并將其整合至lacZ位點；
(3)構建PT7啟動子和tyrA(M53I,A354V)-tyrB的連接片段，并將其整合至tyrR位點。
(4)構建PT7啟動子和aroG(S180F)的連接片段，并將其整合至yghX假基因位點。
4.采用權利要求1所述L-酪氨酸基因工程菌生產L-酪氨酸的方法，其特征在于：搖瓶發酵生產L-酪氨酸的步驟如下：
按10-15％的接種量進行發酵培養，發酵開始時添加10g/L木糖誘導目的基因表達，發酵過程中以苯酚紅作指示劑，通過補加氨水控制pH在7.0-7.2，發髻過程中補加葡萄糖溶液。
5.如權利要求1所述的一種L-酪氨酸基因工程菌生產L-酪氨酸的方法，其特征在于，5L發酵罐發酵生產L-酪氨酸的步驟如下：
(1)種子培養：當種子培養液OD600達到10-15時，準備接入發酵培養基；
(2)發酵培養：按10-15％的接種量將種子液接種至發酵培養基中，發酵開始時添加10g/L木糖誘導目的基因表達，培養溫度為37℃，通過自動流加氨水控制培養基pH為7.0-7.2，通過攪拌和通風控制溶氧在25-30％，以泡敵消泡，當培養基中葡萄糖耗盡時，間歇流加80％的葡萄糖溶液，當發酵液中的L-酪氨酸晶體與泡沫結合在一起時，控制溶氧在30％以上。
6.如權利要求4或5所述的一種L-酪氨酸基因工程菌生產L-酪氨酸的方法，其特征在于：所述發酵培養基為葡萄糖10g/L，木糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，檸檬酸鈉2g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.5mg/L，L-苯丙氨酸0.5g/L，pH 7.0-7.2，115℃高壓蒸汽滅菌15min。
7.如權利要求6所述的L-酪氨酸基因工程菌生產L-酪氨酸的方法，其特征在于：微量元素混合液包括：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO30.125g/L。
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