[發(fā)明專利]一種單細(xì)胞多巴胺受體亞型mRNA表達(dá)的巢式PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810957449.5
• 申請日: 2018-08-22
• 公開（公告）號: CN109182473B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田英芳;劉穎勛;刁志君;任維
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

本發(fā)明公開了一種單細(xì)胞多巴胺受體(Dopamine Receptor,DAR)亞型mRNA表達(dá)的巢式PCR檢測方法。該方法針對DAR的5種亞型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分別設(shè)計兩輪PCR引物，通過巢式PCR進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，實現(xiàn)了單個細(xì)胞DAR亞型的鑒定。同時，通過對內(nèi)參基因(β?actin)的檢測來判斷所抽提的核酸質(zhì)量。因此，該檢測方法結(jié)果可信，靈敏度高，能夠?qū)蝹€細(xì)胞內(nèi)DAR的5種亞型mRNA的表達(dá)同時進(jìn)行定性檢測，適用于神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控機(jī)制研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種單細(xì)胞多巴胺受體亞型mRNA表達(dá)的巢式PCR檢測方法。該方法適用于對單個細(xì)胞的DAR基因表達(dá)情況進(jìn)行分型檢測，進(jìn)而分析不同亞型的DAR在神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)中的作用，探究神經(jīng)元調(diào)控機(jī)制。

背景技術(shù)

多巴胺(Dopamine，DA)是神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種生理活動的調(diào)控，如攝食、運動、內(nèi)分泌、情感發(fā)生等過程。DA對神經(jīng)元的調(diào)控作用主要依賴于神經(jīng)元表面的DAR。DAR是一類由七個跨膜結(jié)構(gòu)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體，大約有400個氨基酸構(gòu)成。DAR有多種亞型且廣泛分布于基底神經(jīng)節(jié)的諸多核團(tuán)，目前在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中已分離鑒定出5種DAR，即Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5。根據(jù)其生物化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，可將DAR分為D1類受體和D2類受體兩大家族。其中，D1類受體包括Drd1和Drd5受體兩種亞型，D2類受體則包括Drd2、Drd3和Drd4三種亞型。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)兩類受體對DA信號呈現(xiàn)出相反的應(yīng)答作用。D1類受體與興奮性G蛋白(Gs)相偶聯(lián)，D1類受體激活后會升高細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP的生成，從而傳遞興奮性信號，以激活突觸后神經(jīng)元。而D2類受體與抑制性G蛋白(Gi)偶聯(lián)，激活后則會降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，傳遞抑制性信號。DA對生理活動的調(diào)控正是通過兩類受體的協(xié)作完成的。如DA對紋狀體中型棘突神經(jīng)元(medium spiny neurons，MSN)的興奮性和GABA神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與DAR類型密切相關(guān)。上游DA信號能夠通過黑質(zhì)紋狀體直接通路激活表達(dá)Drd1的MSN，而通過間接通路抑制表達(dá)Drd2的MSN。基于此，針對主要神經(jīng)元DAR亞型的鑒別與分布，特別是單細(xì)胞水平上的鑒定，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

目前，DAR亞型測定的方法主要有：依賴抗體的免疫印跡、熒光原位雜交(FISH)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基因表達(dá)檢測。應(yīng)用特異的多巴胺配體化合物很容易將Dl類受體和D2類受體家族區(qū)分開來，但大多數(shù)化合物不能區(qū)分同一家族受體的亞型。由于缺乏性能良好的抗體，針對蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫印跡方法對DAR亞型的檢測也受到限制。因此，目前DAR亞型基因表達(dá)檢測常用的方法有FISH和PCR。

其中，F(xiàn)ISH只能在固相切片上，對組織的某一功能區(qū)域或核團(tuán)進(jìn)行原位檢測。神經(jīng)組織核團(tuán)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，神經(jīng)環(huán)路機(jī)制研究工作常需要在保持細(xì)胞活性的狀態(tài)下，對單個神經(jīng)元進(jìn)行功能檢測及DAR基因表達(dá)檢測。FISH無法在此情況下對這種單個神經(jīng)元DAR類型進(jìn)行區(qū)分鑒別。PCR技術(shù)是實驗室常用的一種分子生物學(xué)檢測技術(shù)，操作簡便，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定。使用特定的單細(xì)胞捕獲與操作技術(shù)分離單個神經(jīng)元，提取單細(xì)胞核酸后，可以利用PCR技術(shù)進(jìn)行DAR亞型mRNA的表達(dá)檢測。巢式PCR檢測技術(shù)使用特定的引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，檢測極限能夠到達(dá)pg級別，可以滿足以單個細(xì)胞核酸為模板，對目標(biāo)基因進(jìn)行定性或定量檢測。

目前，常用的單細(xì)胞捕獲與操作的技術(shù)有毛細(xì)管采集技術(shù)、激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)以及熒光活化細(xì)胞流式細(xì)胞儀分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)等實驗方法。其中，膜片鉗(voltageclamp)技術(shù)能夠測量細(xì)胞膜上單個離子通道的電流信息，在細(xì)胞電生理檢測中有著廣泛的應(yīng)用。同時，膜片鉗技術(shù)正是基于毛細(xì)管采集技術(shù)，在顯微鏡下實現(xiàn)了對單個細(xì)胞的分離、操控以及核酸物質(zhì)的抽提。因此，將膜片鉗與單細(xì)胞PCR技術(shù)相結(jié)合，不僅能檢測細(xì)胞的電生理特征，同時能滿足基因表達(dá)檢測，因此在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)有著巨大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容